Твердофазный синтез функционализированных Бис-пептида Использование «Безопасность Поймать« Методология

Общей целью данного эксперимента является синтез функционализированного пептида BSP с использованием твердофазных методов. Это достигается за счет загрузки защищенной аминокислоты BIS на смолу гидроксиэтилбензойной кислоты. Затем повторяются циклы глубокой защиты для присоединения функционализированных аминокислот BIS, что удлиняет пептид BIS и демонстрирует желаемую функциональность.

Наконец, первую аминокислоту bis модифицируют альфа-аминокислотой для того, чтобы отделить пептид BIS от смолы путем образования DI кетопиразина. Получены результаты, которые показывают успешный синтез функционализированного пептида BSP в хорошей сырой чистоте и стабильном изолированном выходе около 10% на основе масс-спектрометрического анализа жидкостной хроматографии. Применение этого метода распространяется на параллельный и библиотечный синтез bis пептидов, поскольку BIS пептиды собираются на твердой смоле, которой легче манипулировать, чем реакциями в растворе, а побочные продукты легко удаляются фильтрацией.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как многие шаги сложны для изучения, потому что есть много важных деталей, необходимых для того, чтобы все реакции приближались к завершению как можно ближе. При твердофазном синтезе нет возможности очистить промежуточные продукты. Таким образом, чтобы получить чистый конечный продукт, каждая реакция должна быть проточена как можно дальше.

Мы рекомендуем составить контрольный список экспериментальных процедур, чтобы избежать путаницы, поскольку шаги повторяются по своей природе. Этот протокол начинается с загрузки первого пептида BSP, защиты первого пептида BSP и одновременного каппинга смолой. Для начала загрузите первый пептид BSP, взвесив 114 миллиграммов смолы H-M-B-A-A, в реакционный сосуд объемом восемь миллилитров и добавьте магнитную мешалку.

Закройте верхнюю часть сосуда резиновой перегородкой и продуйте трубку с помощью Аргонны в течение не менее пяти минут. Тем временем приготовьте активированный раствор аминокислоты BIS, как описано в письменном протоколе. Сопровождая это видео, перелейте раствор в реакционный сосуд с помощью шприца и перемешайте под Аргоннским сосудом на ночь следующего дня, удалите перегородку и слейте реакционную смесь.

Промойте смолу, добавив в смолу примерно два миллилитра хлорметана. Помешивайте от 30 секунд до минуты, а затем слейте воду. Повторите этот процесс четыре раза с помощью DCM, а затем пять раз промойте смолу диметилформамидом.

Для проведения глубокой защиты первой бис-аминокислоты и одновременного укупоривания смолой медленно добавьте в реакционный сосуд два миллилитра раствора 33%-ного бромида водорода в уксусной кислоте и ДКМП. Дайте помешать в течение 15 минут после слива и пятикратной промывки смолы в DCM. Повторите последовательность защиты D еще раз.

Затем промойте смолу пять раз в DCM, а затем пять раз в DMF, нейтрализуйте смолу, дважды промыв 5% объемным раствором D-I-P-E-A в DMF. Затем промойте пять раз DCM и еще пять раз DMF. Теперь можно проводить сопряжение защищенной функционализированной аминокислоты бис.

Во-первых, повторно введите инертную атмосферу в реакционный сосуд, содержащий смолу, путем трехкратной промывки безводным ДХМ. Затем прикрепите септум и аргонновую линию, продуйте и промойте сосуд, добавив один-два миллилитра безводного ДКМП и помешивая в течение 30 секунд. Затем слейте воду из сосуда до тех пор, пока аргонновая линия барботера не начнет подниматься.

Повторите этот процесс еще хотя бы один раз. Затем приготовьте раствор функционализированной аминокислоты бис в высушенной пламенем пробирке в атмосфере Аргонны. Добавьте 47 микролитров DIC и перемешивайте в течение 90 минут.

Затем добавьте 35 микролитров D-I-P-E-A в 666 микролитров и гидрус DMF в смолу и перемешайте еще пять минут. Перенесите предварительно активированный раствор аминокислоты BIS в сосуд с помощью шприца и перемешайте в течение ночи на следующий день. Слейте реакционную смесь и дважды промойте безводным ДКМП, находясь под аргоном.

Важным этапом в этой процедуре является бизнес-аминокислотные соединения. Чтобы обеспечить закрытие кольца кето-пиперазинами, мы используем более длительное время реакции с дополнительными активирующими агентами. Чтобы ускорить закрытие кето-пиразина, добавьте раствор HOAT и DIC, перемешайте его под аргоном в течение одного часа.

Далее снимаем перегородку и сливаем реакционную смесь. Промойте смолу пять раз DCM и пять раз DMF. В этом разделе рассматривается глубокая защита функционализированной аминокислоты BIS, глубокая защита F. moc и ацилирование первой аминокислоты BIS.

Чтобы выполнить глубокую защиту защищенной функционализированной аминокислоты, медленно добавьте два миллилитра раствора TFA и TIPS в реакционный сосуд и перемешивайте в течение одного часа после слива, промойте смолу DCM в течение примерно 30 секунд, а затем слейте воду и повторите промывку DCM пять раз. Затем повторите всю последовательность глубокой промывки защитной смолой после промывки A-D-C-M-D-M-F. Нейтрализуйте смолу, дважды промыв 5%-ным объемным раствором D-I-P-E-A в DMF.

Затем выполните еще одну промывку D-C-M-D-M-F. Отсюда пептид BIS может быть удлинен с другими функционализированными аминокислотами bis или функционализирован на ведущей азоткарбоновой кислоте, или и тем, и другим. Чтобы ослабить защиту FM-группы, добавьте двухмиллилитровый раствор 20%-ного паридина в DMF и перемешайте реакцию в течение 20 минут.

Слейте воду и промойте смолу пять раз в DMF. Повторите этот процесс еще раз после дополнительной промывки смолы. Изолируйте первую аминокислоту, добавив приготовленный раствор аминокислоты в реакционный сосуд и перемешивайте в течение шести часов в качестве заключительного этапа.

Промойте смолу пять раз DCM и пять раз DMF. Заключительная часть этого протокола включает в себя удаление группы Баха из связанной смолой аминокислоты и расщепление из смолы. Сначала добавьте в реакционный сосуд два миллилитра раствора T-F-A-D-C-M и перемешивайте в течение 30 минут.

Слейте воду и промойте смолу пять раз в DCM. Затем повторите этот процесс еще раз. Промойте и слейте смолу в течение 30 секунд, пять раз с помощью DCM и пять раз с помощью DMF.

Далее добавьте два миллилитра раствора 10% D-I-P-E-A в безводный DMF и перемешивайте в течение 24-48 часов. Наконец, соберите реакционную смесь в предварительно взвешенную круглую донную колбу. Перенесите 30 микролитров этого раствора в 450 микролитров Tetra Hydro FU в файл lc MS и отправьте его на анализ.

Промойте смолу с дополнительными аликвотами DMF и соберите в круглую донную колбу. Следующие методы могут быть использованы для мониторинга химических превращений смолы на протяжении всего синтеза. Чтобы обнаружить свободные гидроксильные группы, проведите тест на метиловое красное вещество, сначала удалив примерно один миллиграмм сухой смолы с помощью одноразовой пипетки.

Промойте в реакционном сосуде объемом четыре миллилитра. Добавьте раствор метилового красного, приготовленный, как описано в тексте, и помешивайте в течение пяти-10 минут. Слейте и промойте смолу пять раз с помощью шариков DCM, оранжевые или красные шарики смолы указывают на наличие свободных гидроксильных групп.

Этот тест может быть использован для оценки нагрузки на первые этапы укупорки бис аминокислот и смолы. Чтобы обнаружить вторичные средства, проведите хлоральный тест, перелив примерно один миллиграмм сухой смолы в небольшой флакон с помощью одноразовой пипетки. Добавьте по три капли 0,8 миллимолярного хлораля в раствор ДМФА и 2% кислотного альдегида в раствор ДМФА.

И давайте посидим при комнатной температуре от пяти до 10 минут. В этом случае синие или фиолетовые шарики смолы являются признаком того, что на связанном смоле соединении присутствуют свободные вторичные средства. Для подтверждения эффективности активации проводят тест с ловушкой активации: активированное соединение во время синтеза можно оценить, перенеся от 5 до 10 микролитров активированного раствора во флакон для жидкостной хроматографии, масс-спектрометрический флакон, содержащий 50 микролитров олаина, смешанного вручную.

На несколько секунд раствор должен стать желтым, затем разбавить 450 микролитрами тетрагидроурана и сдать на анализ lc MS. Конечный продукт и активированные промежуточные продукты могут быть оценены с помощью системы LCM S, оснащенной колонной обратной фазы C 18 и системой растворителя водного ацетилнитрила с 0,1% муравьиной кислоты. Эта кривая L-C-M-S-U-V служит примером хорошей чистоты сырого продукта.

основной пик в спектре, обнаруженный на 21,3 минуте, имеет маску, соответствующую ожидаемой массе продукта. Это может быть визуализировано в массовом спектре сырого продукта, пик которого показывает основные пики, соответствующие массе, плюс масса иона натрия, а также масса за вычетом массы защитной группы IV DDE. Здесь показан УФ-след очищенных спектров LCMS, показывающий очень чистый продукт через 21,3 минуты, и масс-спектр, подтверждающий идентичность этого очищенного триерного пика.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать методы твердого лица для синтеза функционализированных бис-пептидов после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области бизнес-пептидов к изучению их применения в белок-белковых взаимодействиях и катализе после освоения. Этот метод может привести к синтезу функционализированного тримера бизнес-пептида за четыре-пять дней, если он выполнен правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что бусины должны быть погружены в реакцию и моющие растворы после этой процедуры. Другие методы, такие как параллельный или библиотечный синтез, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние стереохимии или альтернативных функций на связывание белков или каталитическую активность. Не забывайте, что работа с органическими реагентами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащих средств индивидуальной защиты и вытяжного шкафа.