Синтез и характеристика 1,2-Dithiolane изменение самостоятельной сборки пептиды

По мере роста структур, повышающих функциональность сверхмолекулярных структур, этот метод включения 1,2-дитиолановых групп с самоорганизующимися пептидами может помочь ответить на ключевые вопросы о реакционной способности на сверхмолекулярных поверхностях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что связывание и снятие защиты с молекулы-предшественника 1,2-дитиолана происходит на смоле с помощью только одной стадии очистки конечного модифицированного пептида. Поскольку время, необходимое сборкам для созревания в их окончательные сверхмолекулярные структуры, варьируется, визуальная демонстрация методов характеризации и результатов для сверхмолекулярных сборок имеет решающее значение.

Чтобы синтезировать предшественник дитиолана, сначала растворите один грамм 3-бром-2-проприоновой кислоты примерно в четырех миллилитрах одномолярного гидроксида натрия в 50-миллилитровой реакционной колбе с круглым дном при температуре 55 градусов Цельсия при перемешивании. Когда весь реагент будет взвешенным в растворе, запечатайте реакционную колбу перегородкой и поместите колбу в атмосферу азота. Далее добавьте 1,49 грамма тиоацетата калия и три миллилитра двухмолярной серной кислоты в четыре миллилитра деионизированной воды, чтобы создать тиоуксусную кислоту in situ.

Отасуньте раствор тиоуксусной кислоты в пластиковый одноразовый шприц объемом 10 миллилитров и оснастите шприц иглой 18-го калибра, затем проткните иглой перегородки, чтобы добавить смесь по каплям в реакционную колбу и продолжить реакцию в течение ночи при температуре 55 градусов Цельсия. На следующее утро наблюдайте за реакцией с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля 60 F254 с использованием смеси метанола и дихлорметана и визуализируя ход реакции с помощью бромокрезола зеленого цвета. Когда завершенная реакция остынет до комнатной температуры, подкислите смесь двумолярной серной кислотой до рН одного.

Желтое масло следует отделить из раствора, затем извлечь продукт с тремя 40-миллилитровыми добавками холодного хлороформа и соединить органические слои для сушки над сульфатом магния, удалив хлороформ под пониженным давлением. Продукт должен быть желтым маслом с общим выходом 83% и может использоваться без дополнительной очистки. Чтобы связать предшественник дитиолана с N-концом пептида на смоле, добавьте четыре эквивалента предшественника дитиолана к пяти миллилитрам диметилформамида, четырем эквивалентам HBTU и 10 эквивалентам DIPEA.

Дайте связующей смеси предварительно активироваться в течение 10 минут при комнатной температуре, прежде чем добавлять образец в шприц с фриттингом, содержащий N-концевую смолу. Встряхните реакцию сцепления в течение двух часов, затем три пятимиллилитровые промывки в свежем диметилформамиде и повторите реакцию сцепления и ночное встряхивание. После второго соединения промойте смолу тремя пятимиллилитровыми промывками диметилформамида, а затем тремя пятимиллилитровыми промывками дихлорметановой смолы и перенесите высушенную смолу в 10-миллилитровую микроволновую реакционную трубку.

Затем, чтобы снять защиту тиоацетатной группы с N-концевого предшественника дитиолана, добавьте в пробирку два миллилитра диметилформамида. Дайте смоле набухнуть, добавьте в сосуд небольшую магнитную мешалку и снова суспендируйте смолу с помощью магнитного перемешивания на низкой скорости. Через 15 минут добавьте в пробирку два миллилитра концентрированного гидроксида аммония, закупорьте реакционный сосуд силиконовой перегородкой и поместите сосуд в микроволновый реактор на 45 минут при температуре 75 градусов Цельсия при помешивании.

Когда микроволновая реакция завершится, переложите смолу в чистый, одноразовый шприц с фритлей и промойте смолу двумя пятимиллилитровыми диметилформамидами и двумя пятимиллилитровыми промывками метанола. После последней промывки добавьте пять миллилитров коктейля для расщепления в шприц, содержащий смолу, для инкубации в течение 1 1/2 часа с легким встряхиванием при комнатной температуре. Чтобы приготовить один миллилитр сырого пептида для высокоэффективной жидкостной хроматографии или очистки ВЭЖХ, добавьте 400 микролитров концентрированного пептидного запаса в ацетонитриле в 600 микролитров воды с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты и отфильтруйте раствор через 22-микрометровый шприц-фильтр в флакон ВЭЖХ.

Для очистки пептида используйте полупрепаративную колонку C18 со скоростью потока 3 миллилитров в минуту с линейным градиентом от 15 до 55% ацетонитрила за 20 минут с УФ-детекторами, настроенными на 222 нанометра и 330 нанометров. Затем соберите и объедините пики интересующих вас. Для подтверждения пептидного продукта с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации времени пролета или масс-спектрометрии MALDI-TOF смешайте 0,5 микролитра собранного пика на матричной лазерной десорбционно-ионизационной пластине, содержащей 0,5 микролитра матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты.

Чтобы приготовить раствор для самосборки, растворите один миллиграмм порошка лиофилизированного пептида в смеси 20% ацетонитрила и 10-миллимолярного HEPES в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, затем сделайте раствор для сборки вихревым способом и оставьте образец для сборки при комнатной температуре. Когда пептидная сборка достигнет зрелости, высушите от восьми до 10 микролитров раствора сборки в виде тонкой пленки на ослабленном кристалле алмаза с полным отражением и наблюдайте за исчезновением большого и широкого водного пика от 1640 до 1631 обратного сантиметра по мере формирования сухой пленки. Получайте фоновые и инфракрасные спектры от 1500 до 1800 обратных сантиметров, получая в среднем 50 сканов с разрешением в два обратных сантиметра, вычитая фоновые сканы перед каждым сканированием образца.

Инфракрасную сигнатуру для сборки бета-листа следует наблюдать в виде резкого пика между 1625 и 1635 обратными сантиметрами. Когда образцы пептидов созреют в сверхмолекулярные структуры, богатые бета-листами, загрузите 10 микролитров раствора пептидной сборки на поверхность просвечивающей углеродной сетки электронного микроскопа и дайте сборкам адсорбироваться на поверхности сетки в течение одной-двух минут. Прикоснитесь фильтрующей бумагой к краю сетки, чтобы удалить лишний образец, и добавьте 10 микролитров свежеприготовленного 2%-ного красителя из уранилацетата на поверхность сетки для двух-трехминутной инкубации, затем удалите излишки пятна фильтровальной бумагой и поместите сетку в вакуумный эксикатор на ночь перед визуализацией с помощью просвечивающей электронной микроскопии на следующий день.

Помимо начального одностадийного синтеза молекулы-предшественника дитиолана, остальная часть синтеза 1,2-дитиоланового модифицированного пептида происходит на твердой основе. Превращение 3-бром-2-проприоновой кислоты в 3-2-пропановую кислоту, предшественник дитиолана, подтверждается протонным и углеродным ядерным магнитным резонансом до того, как он соединяется со свободным N-концевым амином пептида, все еще находящегося на смоле. После снятия защиты сырой пептид очищается с помощью обратной фазы ВЭЖХ, а масса продукта подтверждается с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье и круговая дихроизма могут быть использованы для мониторинга самосборки очищенного 1,2-дитиоланового пептида в зрелые амилоидные волокна для характеристики их расширенной конформации бета-листа. Затем волокна могут быть визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Хотя эти методы могут быть использованы для модификации N-конца любой пептидной последовательности, все еще находящейся на смоле, важно помнить, что условия самосборки пептидов должны быть оптимизированы для каждого пептида.

Эти методы, которые добавляют 1,2-дитиолановые группы к самоорганизующимся пептидам, позволят исследователям в области биоматериалов исследовать поверхностную реактивность сверхмолекул.