Juxtasomal Biocytin Маркировка для изучения структуры-функции и отношение отдельных корковых нейронов

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы связать активность потенциалов действия специфических типов клеток в сенсорной коре в процессе обработки информации с морфологической принадлежностью регистрируемых нейронов. Это достигается путем предварительной хирургической подготовки крысы к юкстасоматической регистрации. После подготовки электрод регистрирует спонтанную и вызванную сенсорными стимулами спайковую активность, после чего в регистрируемый нейрон с помощью тока и инъекций вводится биоцидин.

После этого мозг подвергают обработке для окрашивания биотином. В завершение, на основе последующих срезов выполняется цифровая реконструкция заполненного биотином нейрона для классификации типа клеток. В конечном итоге регистрация юксасоматических сигналов отдельных нейронов позволяет изучать сенсорную обработку и структурную информацию внутри кортикальной сети.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, такие как: какова роль отдельных типов клеток и слоев в процессе сенсорной обработки? Как правило, исследователям, которым требуется этот метод, приходится сталкиваться с трудностями, так как нейроны очень легко повредить в процессе заполнения. Вероятность успешного заполнения биоцидином повышается при подготовке пипеток оптимального качества; кроме того, необходим натренированный взгляд для контроля инъекций тока в узком диапазоне.

Следовательно, для повышения процента успешного получения нейронов с хорошим заполнением необходим соответствующий опыт. Для начала поместите анестезированную крысу линии Wistar на стереотаксическую раму, оснащенную нагревательным ковриком. Подтвердите глубину седации, проверив рефлекс отдергивания лапы при сжатии пальца.

Затем введите ректальный датчик для контроля температуры тела. Зафиксируйте голову животного и удалите шерсть с операционного поля. Нанесите глазную мазь для предотвращения пересыхания слизистой оболочки глаз.

Подождите от трех до пяти минут после введения лидокаина в место операции и удалите кожный покров с поверхности черепа. Затем удалите все оставшиеся ткани и тщательно очистите череп 0,9% раствором хлорида натрия. Определите координаты первичной соматосенсорной коры в левом полушарии и отметьте это место на черепе с помощью хирургического маркера для кожи.

С помощью стоматологического бора соскоблите кость в интересующей области. Продолжайте соскабливать кость до тех пор, пока она не станет прозрачной и кровеносные сосуды не станут четко видны. Затем скальпелем вырежьте небольшое окно в тонкой части черепа.

Следите за тем, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку и кровеносные сосуды. Отметьте границы краниотомии с помощью хирургического маркера для кожи. Для улучшения видимости нанесите тонкий слой суперклея на сухой череп, а затем используйте стоматологический цемент для создания ванночки.

При закрытии краниотомии укоротите вибриссы на противоположной стороне точно до пяти миллиметров, чтобы облегчить их визуализацию. Пометьте укороченные вибриссы черной тушью перед началом записей; изготовьте патч-пипетки из боросиликатного стекла. Идеальная морфология пипетки характеризуется постепенным тонким сужением, малым углом конуса и внутренним диаметром кончика приблизительно один микрон.

Заполните патч-пипетку обычным раствором Рингера для грызунов с добавлением 2% биотина, установите её в держатель для пипетки, закрепленный на головке микроманипулятора. Чтобы точно нацелиться на столб D2 в области S1 крысы, установите угол наклона держателя электрода на 34 градуса относительно сагиттальной плоскости. Затем расположите патч-пипетку в непосредственной близости от отверстия трепанации.

Заполните ванночку 0,9% раствором хлорида натрия. Переключив усилитель в мостовой режим, подайте прямоугольные импульсы с положительной инжекцией тока для определения сопротивления электродов. Оптимальное сопротивление электродов должно составлять от трех до пяти МОм.

Создайте избыточное давление от 100 до 150 millibar и продвигайте патч-пипетку шагами по 1 micron, подавая положительный ток в виде прямоугольных импульсов. Отслеживайте значительное изменение сопротивления при установлении контакта с твердой мозговой оболочкой. В этот момент обнулите координаты микроманипулятора для обеспечения точного измерения глубины.

Передвигайте микроманипулятор в режиме шага в один микрон до тех пор, пока патч-пипетка не проткнет твердую мозговую оболочку, что будет отмечено резким падением сопротивления электрода. Снимите поддерживающее давление в пипетке. Затем, продолжая продвижение шагами в один микрон, начните поиск отдельных нейронов.

Непрерывно контролируйте сопротивление электрода, подавая импульсы с периодичностью включения-выключения каждые 200 millisecond; увеличение сопротивления электрода обычно указывает на приближение к отдельному нейрону. Приближайте электрод до тех пор, пока не будут зафиксированы положительные формы волн потенциала действия амплитудой примерно 2 millivolts. При необходимости зарегистрируйте спонтанную спайковую активность и определите активность, вызванную движением вибрисс, осторожно отклоняя отдельные вибриссы с помощью пьезоэлектрического устройства, чтобы создать оптимальные условия для юксомального заполнения.

Перемещайте электрод до тех пор, пока сопротивление не составит 25–35 МОм, а амплитуда спайков не достигнет 3–8 мВ, чтобы начать юкстасомальное заполнение. Подавайте положительные прямоугольные импульсы тока, начиная с 1 нА.

Медленно и постепенно увеличивайте силу тока с шагом 0.1 nano amps, контролируя форму и частоту ПД. Отслеживайте открытие мембраны по четкому увеличению частоты ПД во время фазы включения блокирующего импульса; при заполнении форма спайка характеризуется увеличением ширины и уменьшением последующей гиперполяризации. Увеличивайте или уменьшайте ток во время заполнения для поддержания стабильного введения биотина; прекратите или уменьшите ток импульсов при внезапном увеличении частоты ПД. Это необходимо для предотвращения токсичности, вызванной избыточным притоком внеклеточных ионов, таких как ионы натрия.

Важно отметить, что каждый нейрон будет по-разному реагировать на процедуру заполнения. Поэтому параметры юксомального мечения необходимо корректировать в зависимости от условий регистрации. Внимательно следите за сигналом после прекращения подачи тока.

Форма спайка после сеанса заполнения обычно уширена, и наблюдается значительное сокращение периода послегиперполяризации; необходимо дождаться восстановления нейрона, что становится очевидным, когда форма спайка возвращается к исходным характеристикам, чтобы минимизировать любое механическое воздействие на клетку. Постепенно извлеките патч-пипетку шагами по 1 мкм, пока амплитуда спайка не уменьшится; подождите не менее одного часа для внутриклеточной диффузии биотина, тщательно контролируя температуру тела и дыхание животного. В завершение получают образцы мозга и обрабатывают их для оценки качества юкстасомального мечения.

На этих изображениях представлены нейроны первичной соматосенсорной коры, заполненные методом юкстасоматического введения. Данный тангенциальный вид параметаллического нейрона демонстрирует разницу в размере между дендритами и аксонами. На этой цифровой реконструкции нейрона, маркированного юкстасоматически, изображение проекции нейрона представлено с высоким разрешением, но при малом увеличении; наложенная автоматизированная цифровая реконструкция отображает аксон синим цветом, а дендриты — красным соответственно.

Здесь область рамки расширена, чтобы показать аксональные бутоны по всей длине аксона. В этой финальной анимации мы демонстрируем процесс реконструкции одного толстопочкующего паравентрального нейрона пятого слоя первичной соматосенсорной коры крысы. Этот процесс включает реконструкцию морфологии дендритов и аксонов при 100-кратном увеличении, а также контуров бочек при 4-кратном увеличении.

Результатом является полная 3D-реконструкция, которая впоследствии приводится к стандартной системе координат для количественного анализа морфологических характеристик. Таким образом, прижизненное присоматическое мечение обеспечивает исключительное качество маркировки для достоверной реконструкции полной 3D-морфологии. В данной работе мы продемонстрировали этот метод на животных, находящихся под уретановой анестезией.

Тем не менее, записи Jux Somal также могут быть использованы у бодрствующих животных с фиксированной головой для изучения роли отдельных типов клеток и слоев во время активного исследования окружающей среды. После просмотра этого видео вы получите более четкое представление о том, как проводить маркировку отдельных нейронов Biocidином для последующей идентификации и морфологической реконструкции.