Juxtasomal Biocytin Маркировка для изучения структуры-функции и отношение отдельных корковых нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы связать всплеск потенциала специфического действия типа клетки в сенсорной коре во время обработки информации с морфологической идентичностью зарегистрированных нейронов. Это достигается путем хирургической подготовки крысы к совместным записям. После подготовки электрод регистрирует спонтанную и сенсорно вызванную спайковую активность, а записанный нейрон загружается биоцидином с помощью тока и инъекций.

После этого мозг обрабатывается для окрашивания биотином. Наконец, заполненный биотином нейрон реконструируется в цифровом виде из последующих секций для классификации типов клеток. В конечном счете, сопочные сомальные записи отдельных нейронов позволяют изучать сенсорную обработку и структурную информацию в корковой сети.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, например, какова роль отдельных типов и слоев клеток во время сенсорной обработки? Как правило, люди, нуждающиеся в этом методе, испытывают трудности, потому что во время процедуры пломбирования очень легко убить нейроны. Шансы на успешное наполнение биоцидином увеличиваются за счет подготовки пипеток оптимального качества, а также необходим тренированный глаз для контроля за узкополосными токовыми инъекциями.

Таким образом, требуется опыт, чтобы увеличить вероятность успешного восстановления хорошо заполненных нейронов. Для начала поместите крысу под наркозом Вистар на стереотаксическую рамку, оснащенную грелкой. Подтвердите глубину седации, проверив рефлекс щипкового пальца ноги.

Затем введите ректальный зонд для поддержания правильной температуры тела. Закрепите голову животного и удалите шерсть с места операции. Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.

Подождите три-пять минут после введения лидокаина в месте операции и удалите кожу, покрывающую поверхность черепа. Затем удалите остатки ткани и тщательно очистите череп с помощью 0,9% хлорида натрия. Определите координаты первичной соматосенсорной коры в левом полушарии и отметьте местоположение на черепе хирургическим маркером для кожи.

Используйте бормашину, чтобы соскоблить кость с интересующей области. Продолжайте соскабливать кость до тех пор, пока она не станет прозрачной и кровеносные сосуды не станут хорошо видны. Далее скальпелем прорежьте в тонком черепе небольшое окошко.

Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку и кровеносные сосуды. Отметьте края трепанации черепа хирургическим маркером для кожи. Чтобы улучшить видимость, нанесите тонкий слой суперклея на сухой череп, а затем стоматологический цемент для сооружения ванны.

При закрытии трепанации черепа подрежьте усы на контрлатеральной стороне ровно до пяти миллиметров, чтобы улучшить их видимость. Выделите подстриженные усы черной тушью для ресниц перед началом записи сделайте патч-пипетки из силикатного стекла Boro. Идеальная морфология пипетки — это постепенная тонкая конусность, малый угол конуса и внутренний диаметр наконечника около одного микрона.

Загрузите в патч-пипетку обычный рад-звонарь, дополненный 2%-ным биотином, и установите патч-пипетку на держатель пипетки, закрепленный на головном столике и подключенный к микром-манипулятору. Чтобы целенаправленно нацелиться на столбик D two и на столбик S one, установите угол держателя электрода на 34 градуса по отношению к сагиттальной плоскости. Затем расположите патч-пипетку в непосредственной близости от места трепанации черепа.

Наполните ванну 0,9% хлорида натрия. Когда усилитель находится в мостовом режиме, подайте квадратные импульсы с инжекцией положительного тока для определения сопротивления электрода. Оптимальное сопротивление электродов находится в диапазоне от трех до пяти мега.

Установите избыточное давление от 100 до 150 миллибар и продвигайте патч-пипетку с шагом в один микрон, подавая положительный ток в виде квадратных импульсов. Следите за изменением прочного сопротивления при установлении контакта с твердой мозговой оболочкой. На этом этапе установите координаты микроманипулятора равными нулю, чтобы обеспечить точные измерения глубины.

Продвигайтесь в режиме с шагом в один микрон до тех пор, пока патч-пипетка не проникнет в твердую мозговую оболочку, о чем свидетельствует резкое падение сопротивления электрода. Снимите удерживающее давление пипетки. Далее ищите одиночные юниты, продвигаясь с шагом в один микрон.

Непрерывный контроль сопротивления электродов путем подачи 200 миллисекунд на выключенные импульсы и увеличение сопротивления электрода обычно указывает на близость одного нейрона, продвигающего электрод до положительного действия. Регистрируются формы потенциальных волн примерно в два милливольта. При необходимости можно записать спонтанную активность спайков и определить активность усов, которые были отменены, путем уклонения отдельных усов с помощью пизоэлектрического устройства для получения оптимальных условий для наполнения juxta somal.

Продвигайте электрод вперед до тех пор, пока сопротивление не составит от 25 до 35. Мегаомы и спайки имеют амплитуду от трех до восьми милливольт для запуска гигантского сомального заполнения. Применяйте положительные импульсы прямоугольного тока, начиная с одного наноампера.

Медленно и постепенно увеличивайте ток с шагом 0,1 наноампера, контролируя форму и частоту волны AP. Контролируйте открытие мембраны по мере четкого увеличения частоты АД во время включенной фазы импульса блока, форма спайковой волны во время наполнения показывает увеличенную ширину и уменьшенную после гиперполяризации увеличение или уменьшение тока во время наполнения для поддержания стабильной инфузии биотина, уменьшение или остановку импульсов тока при резком увеличении частоты АД. Во избежание токсичности за счет избыточного притока внеклеточных ионов, таких как ионы натрия.

Важно отметить, что каждый нейрон будет по-разному реагировать на процедуру наполнения. Таким образом, параметры маркировки juxta somal необходимо корректировать в зависимости от условий записи. Внимательно следите за сигналом после остановки инжекции тока.

Форма спайковой волны после сеанса наполнения обычно расширяется и показывает сильно сниженное после гиперполяризации ожидание восстановления нейрона, что проявляется, когда форма спайковой волны возвращается к своим первоначальным свойствам, чтобы уменьшить любое механическое напряжение клетки. Втягивайте пипетку пластыря с шагом в один микрон до тех пор, пока амплитуда спайка не уменьшится, подождите не менее одного часа, пока биотин диффундирует внутриклеточно, внимательно контролируя температуру тела и дыхание животного. Наконец, образцы мозга получают и обрабатывают для выявления качества juxta somal labeling.

Эти изображения показывают изображения juxta mally заполненных нейронов в первичной соматосенсорной коре. Этот тангенциальный вид параметаллического нейрона демонстрирует разницу в размерах между дендритами и аксонами. В этой цифровой реконструкции сомалийского меченого нейрона проекционное изображение нейрона показано с высоким разрешением, но с низким увеличением, и с автоматической цифровой реконструкцией, наложенной аксоном синим цветом, дендритом красным соответственно.

Здесь область коробки расширена, чтобы показать аксон бхутон по всей длине аксона. В этой заключительной анимации мы иллюстрируем конвейер реконструкции одного слоя пятитолщинистого параметаллического нейрона из первичной соматосенсорной коры крысы. Конвейер включает в себя реконструкцию дендритной и аксональной морфологии при 100-кратном увеличении и контуров ствола при четырехкратном увеличении.

Результатом является полная 3D-реконструкция, которая впоследствии регистрируется в стандартизированной системе отсчета для выполнения количественного анализа морфологических характеристик. Таким образом, juxta somal labeling in vivo обеспечивает исключительное качество мечения для надежной реконструкции полной 3D-морфологии. Здесь мы показали метод на животных под наркозом из уретана.

Тем не менее, записи Jux Somal также могут быть использованы на животных с бодрствующей головой для изучения роли отдельных типов клеток и слоев во время активного исследования окружающей среды. После просмотра этого видео у вас должно сложиться лучшее понимание того, как проводить мечение биоцидином отдельных нейронов для послевоенной идентификации и морфологической реконструкции.