Характеристика G-белком с помощью флуоресцентной основе кальция мобилизации Пробирной

Общей целью данного эксперимента является идентификация функционально активирующих лигандов орфанных рецепторов, сопряженных с G-белком, или G-ПЦР. Это достигается путем временного пересечения интересующего A-G-P-C-R и пересечения COT неразборчивой конструкции G alpha 16 в клеточной системе экспрессии для получения временной гетерологичной экспрессии обоих белков. На втором этапе трансфицированные клетки загружаются чувствительным к кальцию красителем flu oh four, который обнаруживает высвобождение кальция из внутриклеточных запасов за счет увеличения флуоресцентного сигнала при взаимодействии с кальцием.

Затем проводят флуоресцентный анализ мобилизации кальция путем воздействия на гетерологичный экспрессированный рецептор с помощью сложной библиотеки лигандов-кандидатов для определения соединений, которые активируют рецептор и вызывают внутриклеточный сигнальный каскад, приводящий к высвобождению кальция из эндоплазматического ретикулума, который может быть измерен как флуоресцентный сигнал. Получены результаты, которые показывают кривую реакции концентрации с половинной максимальной эффективной концентрацией активирующего лиганда, что основано на детектировании различных флуоресцентных сигналов в зависимости от концентраций вводимого лиганда в клеточную систему экспрессии. Основным преимуществом проведения транзиентной трансфекции для получения временной экспрессии вашего GPCR по сравнению с использованием стабильных клональных клеточных линий является то, что оно не требует трудоемкого создания таких стабильно трансфицированных клеточных линий.

Трансфекция неразборчивой субъединицы G alpha 16 может перенаправить внутриклеточный сигнальный путь большинства GPCR в сторону высвобождения кальция независимо от нативного сигнального пути в эндогенных условиях. Таким образом, эта установка позволяет проводить скрининг сотен соединений на интересующих GPCR за короткий промежуток времени, демонстрируя, что процедура будет проводиться на желтом газе, аспирант и Ник Су, техник из нашей лаборатории. Проходите через клетки при достижении слияния 80%. Подготовьте одну колбу T 75 для трансфекции с рецепторной конструкцией и одну для трансфекции с пустым вектором экспрессии в качестве отрицательного контроля.

Инкубируйте колбы при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном 5% CO2, в течение 20–24 часов, пока клеточные культуры не приблизятся к 50–70% конфлюенции, как показано здесь. Затем добавьте 3,9 микрограмма рецепторной конструкции или пустого вектора и 3,9 микрограмма конструкта экспрессии G alpha 16 в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 500 микролитров струйного прайм-буфера.

Хорошо перемешайте, вортексируя трубку с последующим коротким отжимом. Затем добавьте 37,5 микролитров реагента Jet Prime в вихрь и раскрутите в течение одной минуты на максимальной скорости. Инкубируйте трансфекционную смесь в течение 10 минут.

При комнатной температуре пометьте одну популяцию клеток как трансфицированную вектором экспрессии, кодирующим интересующий GPCR и конструкцию G alpha 16, а вторую колбу — пустым вектором и конструкцией G alpha 16. После инкубации добавьте трансфекционную смесь по каплям в среду для клеточных культур, стараясь делать пипетку непосредственно в среду и избегая контакта со стенками колбы для культур. Инкубируйте колбы при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5%-ным увлажнением CO2 в течение 20–24 часов для проведения анализа на мобилизацию кальция.

Трансфицированные клетки собирают и засевают в 96. Хорошо черные стенки с прозрачными донными пластинами. Сначала покройте пластины 60 микролитрами на лунку комнатной температуры.

Фосфатный буферный раствор с фибронектином. Выдерживайте пластины при комнатной температуре в течение одного часа с закрытой крышкой. Достаньте раствор из лунок и снова инкубируйте планшеты в течение одного часа без крышки при комнатной температуре.

Тем временем снимите с клеток старую питательную среду. Промойте мертвые клетки тремя миллилитрами PBS и удалите PBS. Затем добавьте три миллилитра PBS комнатной температуры, попробуйте ЭДТА, поинкубируйте в течение одной минуты перед удалением раствора.

На этом этапе морфология клеток меняется от звездообразной до сферической. Разрыхлите ячейки со дна колбы легкими постукиваниями и соберите их, прополоскав несколько раз 10 миллилитров комнатной температуры. Передаточная среда DM em.

Переложите клетки в соколиную трубку объемом 50 миллилитров. Чтобы подсчитать количество клеток на миллилитр, добавьте 100 микролитров клеточной культуры в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте 100 микролитров буфера для лизиса и перемешайте, постукивая по тюбику.

Наконец, добавьте 100 микролитров стабилизирующего буфера и перемешайте, постукивая. Заполните нуклеокассету клеточной суспензией и подсчитайте клетки счетчиком. Программное обеспечение Nucleo View автоматически умножает количество клеток на три, так как клетки были разбавлены в три раза.

При добавлении лизиса и стабилизирующего буфера разбавьте клетки до конечной концентрации 600 000 клеток на миллилитр и засейте 150 микролитров клеток на лунку в покрытых покрытием планшетах. Чтобы получить плотность ячеек около 90 000 ячеек на лунку, избегайте образования пузырьков воздуха и постукивайте по пластине, чтобы равномерно распределить ячейки. Для того чтобы получить непрерывный клеточный слой, инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5%-ным увлажнением CO2 в течение 16-24 часов.

Выбросьте среду из клеток. Промойте клетки 200 микролитрами PBS на лунку и удалите PBS. Обратите внимание, что все последующие шаги, связанные с операциями с клетками, должны выполняться в темноте, потому что с этого момента клетки будут загружены флюорочетверкой.

Добавьте 55 микролитров загрузочного буфера на лунку, оберните пластину алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить попадание света на пластину, и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре. Затем используйте промывочный буфер для растворения высушенных пептидов в силиконизированных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров. Подготовьте серию разбавлений для проведения анализа реакции концентрации и определения значения EC 50 лиганда.

Имейте в виду, что 50 микролитров лиганда из составной пластины будут перенесены в лунку со 100 микролитрами буфера для промывки на клеточной пластине во время анализа, поэтому приготовьте соединения в три раза выше их желаемой конечной концентрации. Далее добавьте 70 микролитров лиганда в соответствующую лунку составной пластины в трех экземплярах. Включите положительные и отрицательные элементы управления на каждой пластине.

Выбросьте загрузочный буфер с клеточной пластины и добавьте по 100 микролитров промывочного буфера в каждую лунку, предотвращая попадание света. Выдержите тарелку в течение 15 минут при комнатной температуре. Выбросьте промывочный буфер с клеточной пластины и добавьте по 100 микролитров нового промывочного буфера в каждую.

Хорошо инкубируйте клеточную пластину, составную пластину и подставку для наконечников в течение 15 минут. При температуре 37 градусов Цельсия создайте и загрузите нужный файл протокола с помощью программного обеспечения и активируйте блок контроля температуры для камеры чтения здесь. Реакция кальция измеряется при 37 градусах Цельсия в течение двух минут, по одному ряду за раз с интервалом 1,52 секунды между последовательными показаниями на 525 нанометрах.

Установите возбуждение от гриппа на четыре на 488 нанометров и перенесите общий объем 50 микролитров соединения на клеточную пластину. Через 18 секунд после показаний. Начните со скорости дозирования 26 микролитров в секунду и высоты пипетки 135 микролитров.

Расположите компаунд и клеточную пластину, а также штатив для наконечников в соответствующих ящиках станционного устройства. Выполните однократное чтение клеточной пластины с одинаковой длиной волны возбуждения и излучения в режиме конечной точки перед запуском фактического экрана в гибком режиме. Запустите анализ и приступайте к анализу данных с помощью изображенного на рисунке программного обеспечения.

Вот графики, соответствующие одной из трех реплик короткого ряда короткой концентрации НПФ. Отрицательный контроль не индуцировал флуоресцентный сигнал. В то время как положительный контроль вызывал сильную активацию эндогенной протеазы, активировал один рецептор, что приводило к высокому флуоресцентному сигналу.

Программное обеспечение позволяет вводить формулы для определения процента активации или стандартных ошибок различных концентраций среди прочих. Полученные данные используются для составления предварительных кривых реакции концентрации для оценки значений EC 50, показанных для четырех коротких пептидов NPF пищевода. Кривые также включают данные для отрицательного контроля, в котором ряд концентраций коротких пептидов NPF дрозофилы был протестирован на клетках, трансфицированных пустым вектором.

Результаты показывают, что добавление пептидов к этим клеткам не оказывает влияния на эндогенные рецепторы, но активирует интересующий рецептор. Были проведены предварительные кривые реакции концентраций флуоресцентного мобилизационного анализа кальция, и протестированные концентрации были адаптированы для покрытия динамического диапазона кривой. Значения EC 50 у дрозофилы с короткими npf 1, 2, 3 и 4 аналогичны, что указывает на то, что они одинаково активны для активации рецептора после этой процедуры.

Другие методы, такие как структурная активность, исследования отношений, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие аминокислоты пептида имеют решающее значение для активации рецептора. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить мобилизацию кальция на основе флюера для идентификации функционально активирующих лигандов рецепторов, сопряженных с G-белком. Это включает в себя поддержание солнечных экспрессионных систем с последующей трансфекцией клеточной системы с помощью рецептора, представляющего интерес.

После жесткой кальциевой мобилизации можно проводить анализ.