Количественное и размер-профилирование внеклеточной везикул с использованием перестраиваемый Резистивный Pulse Sensing

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественном определении и определении размера профиля внеклеточных везикул с помощью настраиваемого резистивного импульсного зондирования. Стандартный подход заключается в сравнении измерений токовой блокады, взятых из очищенных внеклеточных везикул, с измерениями, взятыми из стандартов полистирольных гранул. Второй подход к характеристике внеклеточных везикул заключается в нанесении на образец гранул полистирола, который используется при работе со сложными образцами, такими как неочищенные внеклеточные везикулы.

В среде для культивирования клеток полученные данные характеризуют размер и количество внеклеточных везикул, независимо от того, являются ли они очищенными или неочищенными. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как вестерн-блоттинг или проточная цитометрия внеклеточных везикул, связанных с латексными гранулами, заключается в том, что этот метод характеризует частицы непосредственно в биологических жидкостях без необходимости физической изоляции или маркировки. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что внеклеточные везикулы неоднородны по размеру.

При попытке обнаружить более мелкие везикулы, более крупные везикулы могут закупорить нанопоры. Мы добавили в протокол несколько практических советов и рекомендаций для быстрого возвращения к работоспособным условиям. Мы попытались уменьшить производство внеклеточных везикул и нуждались в методе количественной оценки концентрации везикул в клеточной культуре. Снет.

В поисках методов для определения характеристик наночастиц мы наткнулись на TRPS и модифицировали его протоколы, чтобы они были более подходящими для характеристики наночастиц и клеточных культур. S-надосадочная жидкость и другие биологические жидкости Начните с подключения прибора TRPS к компьютеру с установленным на нем программным обеспечением пакета управления. Обязательно сведите к минимуму электрические помехи, как описано в текстовом протоколе.

Теперь выберите размер нанопор. NP 100 является лучшим выбором для везикул размером от 70 до 200 нанометров, в то время как NP 150 можно использовать для везикул размером от 85 до 300 нанометров. NP 200 лучше подходит для измерения везикул размером от 100 до 400 нанометров.

Затем выберите дополнительные калибровочные частицы полистирола для NP 100 и NP 150, выберите калибровочные частицы CPC 100 для NP 200. Используйте калибровочные частицы CPC 200. Переведите калибровочные частицы на вихрь в течение 30 секунд.

Если они все еще агрегированы, используйте ультразвук, а затем разбавьте калибровочные частицы в PBS до целевой концентрации. Исходя из размера нанопор, конечный объем должен быть не менее 40 микролитров. Теперь намочите нижнюю жидкостную ячейку инструмента, нанеся 78 микролитров PBS и сразу же удалив ее.

Это снижает риск образования пузырьков под нанопорами. Затем поместите нанопор в кронштейны инструмента. Измерьте расстояние между двумя противоположными рычагами с помощью цифровых штангенциркулей.

Введите это значение в программное обеспечение в поле под названием stretch и после ввода нажмите на Calibrate stretch с помощью бокового колеса, которое контролирует расстояние между противоположными руками. Растягиваем нанопоры до 47 миллиметров. Растянув до нужного размера, повторно нанесите 78 микролитров PBS на нижнюю ячейку жидкости.

Начните процесс калибровки, поместив верхнюю жидкостную ячейку на нанопору и прикрепив защитный каркас. Затем добавьте 40 микролитров разведенных калибровочных частиц в верхнюю ячейку жидкости. Теперь приложите не менее 0,8 кПа положительного давления.

С помощью модуля переменного давления или VPM выберите положительное напряжение и нажмите включить. Затем медленно уменьшайте растяжение во время анализа блокады. События, вызванные калибровочными частицами.

По мере уменьшения растяжения высота блокады будет постепенно увеличиваться, и таким образом соотношение сигнал/шум будет улучшаться. Увеличение напряжения также может увеличить высоту блокады, но также может привести к увеличению среднеквадратичного шума. Прекращайте уменьшение растяжения, когда наблюдаемые блокировки соответствующим образом превышают фоновые уровни, отмеченные на панели трассировки сигнала.

Во-вторых, следите за скоростью частиц. Однако у него есть менее строгая граница. В идеале скорость частиц должна быть не менее 100 в минуту.

Однако, если скорость частиц превышает 2000 в минуту, разбавьте образец и повторно откалибруйте прибор. Такой высокий уровень может привести к неточным измерениям для этой демонстрации. Охарактеризованы ранее очищенные внеклеточные везикулы из клеточной линии опухоли головного мозга.

Начните с загрузки калибровочных частиц в пресс верхних жидкостных ячеек. Включите, затем надавите с помощью VPM и запишите сюда не менее 500 частиц данных. Применяется давление 0,8 килопаскаль.

В качестве опции можно также выполнить многократное измерение давления, чтобы увеличить приложенное давление и записать второй файл калибровки. Теперь шаг давления должен быть не менее 0,2 кПа Сальдо, извлеките образец из верхней ячейки и трижды промойте ячейку 100 микролитрами PBS на одну промывку. После стирки протрите верхнюю ячейку жидкости безворсовой бумагой.

Далее добавьте экспериментальный образец. Базовый ток должен быть в пределах 3% от тока, наблюдаемого при измерении калибровочных частиц. Если нет, постучите или поверните защитный колпачок, приложите поршень или полностью удалите нанопоры и промойте их водой.

Если наблюдаемый ток хороший, приложите точно такое же давление, как и к калибровочным частицам. Затем запишите не менее 500 частиц и сохраните файл с данными. Если происходит внезапное прерывание обнаружения частиц, падение базового тока или внезапное увеличение среднеквадратичного шума, то приостановите запись и попытайтесь очистить нанопоры.

Как и раньше, пипетируйте образец вверх и вниз. Постучите или поверните защитный колпачок, приложите поршень или полностью удалите нанопоры и промойте их деионизированной водой. Другая стратегия заключается в том, чтобы увеличить растяжение нанопор до 47 миллиметров и максимизировать давление от VPM в течение примерно пяти минут.

Поскольку это также может привести к отключению НКО от программного обеспечения. Перейдите на вкладку «Анализ данных» и начните обработку данных, щелкнув правой кнопкой мыши по опции «Необработанные файлы» и выбрав опцию «Обрабатывать файлы». Затем, чтобы связать образцы и файлы калибровки, установите флажок рядом с образцом.

В откалиброванной колонке выберите соответствующие файлы и окей. Выбор. Программное обеспечение будет отображать различные характеристики образца, такие как размер, распределение, базовая продолжительность, полная ширина, половинный максимум и аналитика концентрации.

Для таких образцов, как биологические жидкости, которые приводят к чрезмерному засорению стандартным методом при подготовке используется следующий подход: центрифугированием не менее 50 мкл клеточной культуры. Надосадочная жидкость, содержащая внеклеточные везикулы, в течение семи минут при 300 G. Также приготовьте отдельную среду контроля одинаковым образом как для образца, так и для контроля. Перенесите 20 микролитров надосадочной жидкости в новые пробирки и добавьте 20 микролитров PBS и 10 микролитров разбавленного полистирольного шарика размером 335 нанометров из расчета 10 миллионов гранул на миллилитр.

Теперь настройте прибор так же, как и раньше, используя нанопоры NP 200 и измерьте контрольный образец только гранул в среде. Во-первых, для обеспечения точности фоновое обнаружение мелких частиц, не содержащих шариков, должно быть сведено к минимуму до менее чем 10% от общего количества обнаруженных шариков. Теперь измерьте каждый образец один раз перед повторением записи.

Это распределит колеблющиеся условия нанопор по образцам. Каждый образец должен быть измерен три раза в полной степени путем повторного измерения только образца калибровочного валика. Позже. Во время анализа данных используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для расчета концентрации.

Пример расчета прилагается к письменному протоколу. Внеклеточные везикулы выделяли из трех клеточных культур U 87 M-G-E-G-F-R-V, супернатант методом ультрацентрифугирования, а затем измеряли по описанному протоколу с использованием калибровочных шариков длиной 115 нанометров. Получено распределение по размерам внеклеточных везикул.

Внеклеточные везикулы также количественно определяли непосредственно из надосадочной жидкости клеточной культуры глиобластомы с использованием альтернативного подхода, который подгоняет образец к стандарту. Наблюдались две популяции наночастиц. Меньшие внеклеточные везикулы и более крупный известный стандарт, оценка размера двух популяций на основе известного стандарта, идентифицировали популяцию везикул как более 140 нанометров.

Меньшие внеклеточные везикулы могли быть обнаружены с помощью меньшего отверстия в нанопорах, но после освоения было бы больше засорения. Этот метод может быть выполнен за один-четыре часа в зависимости от количества анализируемых образцов. При выполнении этой процедуры важно помнить, что образцы могут потребовать корректировки перегородки в соответствии с протоколом.

Например, образцы, состоящие из более крупных везикул, могут потребовать использования более крупных нанопор при относительно большом растяжении, а также измерения могут быть облегчены фильтрацией образцов методом центрифугирования для удаления клеточного мусора, который может синхронизировать нанопоры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как охарактеризовать внеклеточные везикулы с помощью TRPS. В зависимости от образца внеклеточных везикул вы можете применить стандартный протокол или использовать метод скорректированного спайка.