Количественное и размер-профилирование внеклеточной везикул с использованием перестраиваемый Резистивный Pulse Sensing

Общая цель следующего эксперимента заключается в количественном определении и анализе профиля размеров внеклеточных везикул с помощью перестраиваемого резистивно-импульсного сенсора. Стандартный подход состоит в сравнении показателей блокады тока, полученных от очищенных внеклеточных везикул, с показателями стандартных полистирольных микросфер. Второй подход к характеристике внеклеточных везикул заключается в добавлении полистирольных микросфер в образец; этот метод используется при работе со сложными образцами, такими как неочищенные внеклеточные везикулы.

При использовании среды для культивирования клеток полученные данные характеризуют размер и количество внеклеточных везикул, независимо от того, являются ли они очищенными или неочищенными. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как вестерн-блоттинг или проточная цитометрия внеклеточных везикул, связанных с латексными микросферами, является то, что этот метод позволяет характеризовать частицы непосредственно в биологических жидкостях без необходимости их физического выделения или маркирования. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за гетерогенности внеклеточных везикул по размеру.

При попытке обнаружить мелкие везикулы более крупные везикулы могут забить нанопору. Мы добавили в протокол несколько практических советов и приемов, позволяющих быстро вернуть систему в рабочее состояние. Мы попытались снизить выработку внеклеточных везикул, и нам потребовался метод количественного определения концентрации везикул в клеточной культуре.Snet.

В поиске методов характеристики наночастиц мы обратили внимание на TRPS и модифицировали его протоколы, чтобы сделать их более подходящими для анализа экзосом, супернатантов клеточных культур и других биологических жидкостей. Начните с подключения прибора TRPS к компьютеру, на котором установлено программное обеспечение EyesOn Control Suite. Обязательно сведите к минимуму электрические помехи, как описано в текстовом протоколе.

Теперь выберите размер нанопоры. NP 100 является оптимальным выбором для везикул размером от 70 до 200 нм, в то время как NP 150 может быть использована для везикул размером от 85 до 300 нм. NP 200 лучше подходит для измерения везикул размером от 100 до 400 нм.

Затем подберите соответствующие калибровочные частицы из полистирола для NP 100 и NP 150; для NP 200 выберите калибровочные частицы CPC 100. Используйте калибровочные частицы CPC 200. Перемешайте калибровочные частицы на вортексе в течение 30 секунд.

Если частицы все еще агрегированы, используйте соникацию, затем разведите калибровочные частицы в PBS до целевой концентрации. В зависимости от размера нанопоры конечный объем должен составлять не менее 40 µL. Теперь увлажните нижнюю жидкостную кювету прибора, нанеся 78 µL PBS и немедленно удалив его.

Это снижает риск образования пузырьков воздуха под нанопорой. Затем поместите нанопору между зажимами прибора. Измерьте расстояние между двумя противоположными зажимами с помощью цифрового штангенциркуля.

Введите это значение в программном обеспечении в поле stretch, после чего нажмите calibrate stretch, регулируя расстояние между противоположными рычагами с помощью бокового колеса. Растяните нанопору до 47 millimeters. После достижения необходимого размера снова добавьте 78 µL PBS в нижнюю жидкостную ячейку.

Начните процесс калибровки, установив верхнюю жидкостную ячейку на нанопору и закрепив защитную клетку. Затем добавьте 40 µL разбавленных калибровочных частиц в верхнюю жидкостную ячейку. Теперь подайте избыточное давление не менее 0.8 kPa.

Используя модуль переменного давления (VPM), выберите положительное напряжение и нажмите кнопку включения. Затем медленно уменьшайте растяжение, анализируя блокаду. События вызываются калибровочными частицами.

По мере уменьшения растяжения высота блокады будет постепенно увеличиваться, что приведет к улучшению соотношения сигнал/шум. Повышение напряжения также может увеличить высоту блокады, но при этом может возрасти среднеквадратичный шум. Прекратите уменьшать растяжение, когда наблюдаемые блокады будут надлежащим образом превышать уровень фона, что можно определить по панели трассировки сигнала.

Во-вторых, проконтролируйте скорость поступления частиц. Однако для этого параметра установлены менее строгие критерии. В идеале скорость поступления частиц должна составлять не менее 100 в минуту.

Однако, если скорость поступления частиц превышает 2000 в минуту, разбавьте образец и заново откалибруйте прибор. Столь высокая скорость может привести к неточным измерениям в данной демонстрации. Проводится характеристика предварительно очищенных внеклеточных везикул из клеточной линии опухоли головного мозга.

Начните с загрузки калибровочных частиц в верхний пресс жидкостной ячейки. Включите прибор, затем приложите давление с помощью VPM и зарегистрируйте данные как минимум для 500 частиц. Прикладывается давление 0.8 kilopascal.

При необходимости для этого можно провести измерение при нескольких значениях давления: увеличьте приложенное давление и запишите второй калибровочный файл. Шаг изменения давления должен составлять не менее 0,2 kilopascals. Теперь извлеките образец из верхней ячейки и трижды промойте ячейку, используя по 100 µL PBS для каждой промывки. После промывок протрите верхнюю жидкостную ячейку безворсовой салфеткой.

Затем добавьте экспериментальный образец. Базовый ток должен находиться в пределах 3% от тока, наблюдаемого при измерении калибровочных частиц. Если это не так, слегка постучите по экранирующему колпачку или поверните его, нажмите на поршень или полностью извлеките нанопору и промойте её деионизированной водой.

Если наблюдаемый ток в норме, подайте точно такое же давление, какое применялось к калибровочным частицам. Затем зарегистрируйте не менее 500 частиц и сохраните файл с данными. В случае внезапного прекращения регистрации частиц, падения базового тока или резкого увеличения среднеквадратичного шума (RMS) приостановите запись и попытайтесь прочистить нанопору.

Как и прежде, несколько раз перемешайте образец с помощью пипетки. Постучите по экранирующей крышке или поверните ее, нажмите на поршень или полностью извлеките нанопору и промойте ее деионизированной водой. В качестве альтернативной стратегии можно увеличить растяжение нанопоры до 47 мм и максимально увеличить давление от VPM примерно на пять минут.

Поскольку это также позволяет программно отключить NPO. Перейдите на вкладку анализа данных (analyze data) и начните обработку данных, щелкнув правой кнопкой мыши по опции необработанных файлов (unprocessed files) и выбрав пункт обработки файлов (process files). Затем, чтобы связать файлы образцов и калибровочные файлы, установите флажок рядом с образцом.

В откалиброванной колонке выберите соответствующие файлы и нажмите ОК. Программное обеспечение отобразит различные характеристики образцов, такие как размер, распределение, длительность базовой линии, полная ширина на полувысоте и аналитику концентрации.

Следующий подход используется для таких образцов, как биологические жидкости, которые вызывают чрезмерное засорение при использовании стандартного метода подготовки: центрифугируйте не менее 50 µL культуральной среды, содержащей внеклеточные везикулы в супернатанте, в течение семи минут при 300 ×g. Аналогичным образом подготовьте контрольный образец, содержащий только среду. Перенесите 20 µL супернатанта в новые пробирки, добавьте 20 µL PBS и 10 µL разведенного стока полистирольных микросфер диаметром 335 nm с концентрацией 10 million beads per milliliter.

Теперь подготовьте прибор, как и ранее, используя NP 200 Nanopore, и измерьте контрольный образец, состоящий только из микросфер в среде. Сначала, для обеспечения точности, необходимо минимизировать фоновое детектирование мелких частиц, не являющихся микросферами, до уровня менее 10% от количества детектируемых микросфер. Теперь измерьте каждый образец один раз перед записью повторностей.

Это позволит распределить колебания условий в нанопоре между образцами. Каждый образец должен быть измерен трижды; в завершение следует провести повторное измерение образца, содержащего только калибровочные микросферы. Впоследствии, при анализе данных, используйте электронные таблицы для расчета концентрации.

Пример расчета приведен в письменном протоколе. Внеклеточные везикулы были очищены из супернатанта трех культур клеток U 87 M-G-E-G-F-R-V методом ультрацентрифугирования, после чего их параметры измеряли согласно описанному протоколу с использованием калибровочных частиц размером 115 nanometer. В результате было получено распределение внеклеточных везикул по размеру.

Количество внеклеточных везикул также определяли непосредственно в супернатанте культуры клеток глиобластомы, используя альтернативный подход с добавлением стандарта в образец. Были обнаружены две популяции наночастиц. На основании размера известного стандарта была проведена оценка размеров двух популяций — меньших внеклеточных везикул и более крупного стандарта, в результате чего размер популяции везикул был определен как более 140 нанометров.

Более мелкие внеклеточные везикулы могли быть обнаружены при использовании нанопор с меньшим диаметром отверстия, однако в этом случае чаще возникали засоры. После освоения данная методика может быть выполнена за один-четыре часа в зависимости от количества анализируемых образцов. При выполнении этой процедуры важно помнить, что для некоторых образцов может потребоваться корректировка протокола в части использования септы.

Например, для образцов, содержащих более крупные везикулы, может потребоваться использование нанопор большего размера при относительно большом растяжении; также измерения можно облегчить, отфильтровав или центрифугировав образцы для удаления клеточного дебриса, который может засорить нанопору. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить характеристику внеклеточных везикул с помощью TRPS. В зависимости от вашего образца внеклеточных везикул вы можете применять стандартный протокол или использовать модифицированный метод с добавлением стандарта (spike-in method).