Массив сравнительная геномная гибридизация (Array CGH) для обнаружения геномной количество копий Варианты

Общая цель данной процедуры заключается в проведении сравнительной геномной гибридизации на микрочипах для выявления дисбалансов в геноме, которые могут привести к широкому спектру генетических заболеваний. Это достигается путем первоначального мечения ДНК пациента флуоресцентным красителем. На втором этапе ДНК пациента и референсная ДНК с другим мечением гибридизируются с микрочипом.

Затем проводится сканирование матрицы для измерения количества ДНК пациента и референсной ДНК, связавшихся с каждым зондом. На заключительном этапе отсканированное изображение обрабатывается для выявления регионов генома, в которых количество материала ДНК пациента больше или меньше, чем в соответствующем регионе референсной ДНК на матрице. Сравнительная геномная гибридизация используется для определения того, является ли пациент носителем варианта числа копий, который приводит к генетическому синдрому.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как сборка предметного стекла с массивом может быть затруднительна, и легко допустить разлив содержимого камеры перед началом реакции мечения. Разморозьте готовую к использованию 96-луночную плату с нуклеотидами и праймерами при температуре 4 °C в защищенном от света месте в течение примерно одного часа.

После размораживания выдержите закрытый планшет еще 30 минут при комнатной температуре; в это же время доведите образцы ДНК до равновесия, выдержав их 15 минут при 60 °C. Пока образцы нагреваются, с помощью робота для работы с жидкостями разлейте достаточное количество воды, свободной от нуклеаз, в каждую лунку нового 96-луночного планшета. Затем, когда ДНК будет готова, перенесите в каждую лунку планшета с водой по 1 µg образца.

Теперь перенесите по 20 µL уравновешивающих нуклеотидов и праймеров в каждую лунку планшета с разведенными образцами ДНК и закройте планшет стрипами-крышками, обеспечив плотное прилегание. Затем денатурируйте ДНК при 99 °C в амплификаторе с подогреваемой крышкой в течение 10 минут и отжгите праймеры, подвергнув планшет резкому охлаждению на льду в течение пяти минут. После этого с помощью робота для работы с жидкостями добавьте по 10 µL фермента CleanOut Exo DNA-полимеразы в каждый образец.

Перемешайте образцы с помощью пипетки, затем запечатайте планшет и инкубируйте его при 37 °C в течение 16 часов. На следующий день остановите реакцию, добавив по 5 µL стоп-буфера в каждую лунку. Затем удалите неиспользованные нуклеотиды. Перенесите содержимое каждой лунки в отдельные предварительно маркированные пробирки объемом 2 мл.

Загрузите образцы, спин-колонки для очистки ДНК, а также соответствующие сопутствующие буферы в робот для обработки спин-колонок. Согласно инструкциям производителя, робот для обработки спин-колонок свяжет меченую ДНК с силикатной мембраной с использованием 250 microliters буфера для связывания ДНК с высоким содержанием солей на каждую пробирку, после чего примеси будут удалены с мембран путем двух промывок буфером для промывки по 500 microliters каждая. Затем робот добавит на мембраны 15 microliters элюирующего буфера с низким содержанием солей, чтобы восстановить очищенные образцы меченой ДНК в объемах приблизительно 12 microliter для последующей гибридизации образцов.

Затем предварительно нагрейте гибридизационный печь до 65 °C и прогрейте поддерживающие стекла и гибридизационные камеры. Для приготовления гибридизационной смеси смешайте 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL блокирующей смеси от производителя и 24,75 µL гибридизационного буфера. Используйте робот для работы с жидкостями, чтобы разнести эту смесь по каждой лунке нового 96-луночного планшета, предварительно смачивая каждый наконечник для повышения точности переноса.

Затем пипеткой внесите 9,35 µL соответствующего меченого ДНК-зонда 3, после чего добавьте 9,35 µL соответствующего меченого ДНК-зонда 5. Герметично закройте планшет, подвергните образцы воздействию в течение одной минуты, а затем быстро центрифугируйте планшет, чтобы собрать содержимое на дне каждой лунки. Денатурируйте меченую ДНК в инкубаторе для предварительной гибридизации.

Сначала в течение трех минут при 95 °C, затем в течение 30 минут при 37 °C. Далее работа проводится на нагревательной платформе при 42 °C. Поместите предметное стекло в гибридизационную камеру, убедившись, что прозрачная часть прокладки совмещена с оконной частью гибридизационной камеры, используя предварительно смоченные наконечники.

Теперь медленно внесите пипеткой 42 µL гибридизационной смеси в центр соответствующей позиции на подложке для массива. Следите за тем, чтобы жидкость не касалась границы резинового кольца. После заполнения всех позиций осторожно опустите слайд массива на подложку и соберите гибридизационную камеру.

Убедившись, что сторона массива с надписями обращена к supporting-слайду, полностью затяните винт гибридизационной камеры и осмотрите собранную гибридизационную камеру, чтобы подтвердить отсутствие утечек гибридизационной смеси за пределами резинового кольца и убедиться, что высота каждого пузырька воздуха составляет примерно четыре миллиметра. Для этого установите гибридизационную камеру вертикально и поверните её.

Все пузырьки воздуха в каждой позиции перемещаются. Если какие-либо из пузырьков застряли, резко постучите по камере о поверхность лабораторного стола. Затем поместите гибридизационные камеры в ротационный печь при температуре 65 °C на 24 часа.

На следующий день погрузите камеры гибридизации в промывочный буфер 1 и с помощью пластического пинцета с плоскими краями аккуратно разделите стекла. Затем удалите стекла-прокладки, а стекла с массивом поместите в штатив, погруженный в свежий буфер 1. Промывайте стекла с массивом в приблизительно 700 миллилитрах промывочного буфера от одной до пяти минут, интенсивно перемешивая с помощью магнитного якоря и мешалки.

Затем перенесите предметные стекла с массивом примерно в 700 миллилитров промывочного буфера; проведите две промывки по 90 секунд, в конце второй из них перемешивая содержимое более интенсивно. Осторожно поднимите стекла с массивом из буфера. Они должны быть сухими.

Затем поместите слайды с микрочипами в держатели сканера вместе с защитными накладками и проведите сканирование образцов. Согласно инструкциям производителя микрочипов, каждый зонд на гибридизованном массиве визуализируется как смесь красного и зеленого флуорохромов. Отношения красного и зеленого флуоресцентного сигналов для каждого зонда количественно определяются сканером, и соответствующее программное обеспечение представляет их в виде логарифмических отношений с основанием два (log₂ ratios) в соответствии с их геномным положением.

Полученные графики микромассива позволяют интерпретировать области, определенные как геномно несбалансированные. Например, на этом графике, полученном от ребенка с синдромом Уильямса — рекуррентным синдромом микроделеции, обусловленным низкокопийными повторами в проксимальной области хромосомы 7, геномный дисбаланс был отмечен программным обеспечением красной линией. Логарифмическое отношение флуоресценции должно группироваться вокруг нуля, что указывает на соотношение зеленого и красного каналов 1:1 для нормальных участков генома.

Разрозненные следы массива, наблюдаемые при данном сканировании, могут привести к неточному определению аномальных участков или к невозможности выявить геномный дисбаланс; они могут быть вызваны рядом факторов, включая низкое качество ДНК, воздействие излучения или уровень озона в атмосфере. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как подготавливать образцы пациентов для анализа методом aCGH и как получать данные высокого качества для последующего анализа и выявления вариаций числа копий.