Выделение CD4 + Т-клеток от мышей лимфатических узлов с помощью Miltenyi MACS очистки

Это магнит Max MIDI. В нем говорится, осторожно, чрезвычайно сильные магнитные поля. Здравствуйте, меня зовут Мелани Мэтью из лаборатории Майка Коллинза на факультете физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвине.

Сегодня мы покажем вам препарат отрицательного отбора CD четырех положительных Т-клеток с помощью биотехнологических наборов Milton. Итак, здесь у нас есть минимакс и минимакс магниты, и минимакс используется для больших разделений. Вы можете пропустить до 10 до девятой ячеек через столбец, который помещается в минимакс, а минимакс используется для гораздо меньших объемов ячеек.

Таким образом, в зависимости от того, проводите ли вы положительное или отрицательное разделение, вы будете помечать свои клетки соответствующими антителами. На них есть магнитный бич, который будет прикрепляться к магниту. В случае отрицательного выбора, ячейки, которые вас интересуют, будут проходить через столбец, и вы сможете собрать загрязнитель EL, который будет содержать интересующие вас клетки.

Я должен упомянуть, что техники, которые я покажу вам сегодня вечером, не стерильны. И поэтому, если вы хотите использовать эти клетки для культивирования клеток, вы должны делать все в капюшоне для культивирования тканей с помощью стерильных инструментов. Так что, несмотря на то, что я показываю вам подготовку к CD4-положительным Т-клеткам, многие из этих методов применимы для очистки других типов клеток с помощью крошечных биотехнологических наборов.

Итак, я удалил лимфатические узлы у мыши и покажу вам, как это сделать в деталях в седьмом выпуске книги «Подготовка лимфатических узлов Джо к двухфотонной визуализации». А теперь я собираюсь измельчить лимфатические узлы в одноклеточную суспензию внутри 70-микронного клеточного фильтра. Итак, теперь я собираюсь измельчить лимфатические узлы в одноклеточную суспензию с помощью задней части шестимиллилитрового шприца.

Лимфатические узлы находятся в RPMI внутри фильтра, и важно сделать надлежащую суспензию для одиночных клеток. И причина, по которой мы делаем это в фильтре, заключается в том, что вы хотите убедиться, что у вас нет никаких скоплений клеток. Итак, когда я закончу шлифовку, я собираюсь вытащить фильтр из фильтрующего материала, а затем использовать все, что прошло через сетчатое фильтр и одноклеточную суспензию.

Когда вы измельчаете, вы должны быть уверены, что разрушаете все ткани как можно сильнее. Эта суспензия одиночных клеток — это то, от чего мы будем очищать наши CD четыре положительные Т-клетки. Итак, теперь я закончил шлифовку ткани, и вы можете видеть, что большинство лимфатических узлов практически исчезли.

У нас все еще есть небольшие кусочки жира и своего рода оболочка лимфатического узла с небольшим количеством соединительной ткани, которая слиплась из всех шести лимфатических узлов. А теперь снимаю ситечко с ячейки. И здесь вы можете видеть, что СМИ очень мутные.

Он наполнен клетками из одноклеточной суспензии, чтобы гарантировать, что мы получим максимальное количество клеток из фильтра, и некоторые из них прилипнут к нему. Я промываю его парой мил среды, а затем помещаю всю среду в пробирку Falcon объемом 15 мил и раскручиваю ее, чтобы подвергнуть клетки последующей очистке. Итак, вот моя одноклеточная суспензия, раскрученная и гранулированная при 300 G в течение 10 минут.

Если вы думаете, что у вас будет большое количество мертвых клеток в суспензии одиночных клеток, рекомендуется использовать набор для удаления мертвых клеток от Milit Tene. Итак, теперь, когда я это забросал, я собираюсь слить среду и провести лизис эритроцитов, а затем я собираюсь посчитать клетки, а затем сделать набор для отбора CD четырех положительных Т-клеток на этих конкретных клетках. Итак, теперь я собираюсь сделать лизис эритроцитов.

Мы собираемся лизировать красные кровяные тельца, которые мы гранулировали, вместе с лимфоцитами, уменьшая осмолярность раствора, сначала добавляя воду, а затем доводя его до одного раствора, добавляя 10 X-D-B-P-S. Наши лимфоциты более устойчивы к изменению осмолярности, чем эритроциты, но мы все равно должны работать быстро, иначе наши лимфоциты будут работать, чего мы не хотим делать. Часть быстрой работы заключается в том, что я заполняю объемы, которые мне понадобятся для лизиса, прежде чем добавлять воду в систему.

Поэтому я хочу иметь возможность добавить свои 10 X-D-B-P-S-A через несколько секунд после добавления воды, чтобы убедиться, что я не лизирую свои лимфоциты и не корректирую лис эритроцитов. Поэтому я беру 900 микролитров воды. Это почти мельница и сотня микролитров 10 X-D-B-P-S.

У меня обе трубы готовы к работе. В лизис я добавляю воду, жду пару секунд, может быть, немного встряхиваю тюбик, а затем добавляю 10 X-D-B-P-S, встряхиваю тюбик еще немного. И если у вас много красных кровяных телец, которые являются лизином, вы увидите большой вид аморфной формы капли всех разрушенных клеточных мембран.

У нас здесь есть немного этого, и вы можете видеть, что это немного разрушенных клеточных мембран. Итак, после того, как я сделал лизис, на случай какой-либо ошибки при пипетировании, я предпочитаю добавлять несколько миллей среды в клетки, чтобы убедиться, что осмолярность правильная, и мы больше не продолжаем использовать лизин. Итак, теперь у меня есть лимфоциты в одноклеточной суспензии.

Опять же, я провел лизис красных кровяных телец, и я собираюсь раскрутить их и измельчить. Прежде чем я это сделаю, я собираюсь посчитать их на гемоцитометре, чтобы определить, сколько антител нам нужно добавить для набора для отбора CD четырех положительных Т-клеток. Итак, теперь я трачу ячейки в максимальном буфере, и вы можете видеть, что гранула стала намного более белой после того, как мы сделали лизис эритроцитов.

И я собираюсь провести отрицательный отбор для CD четырех положительных Т-клеток. Итак, я собираюсь слить всю среду, весь максимальный буфер, в котором я провожу ячейки. И я собираюсь пометить коктейлем антител к биотину, который является первым шагом в отрицательном отборе для CD четырех положительных Т-клеток.

А потом выдерживаю в холодильнике 10 минут. Итак, мои клетки закончили свою первоначальную инкубацию. Теперь я собираюсь добавить антибиотик к микрогранулам и положить их обратно в холодильник на 15 минут.

Итак, для этого конкретного разделения клеток мы используем колонку LS от крошечной биотехнологической компании Milit, и мы собираемся поместить ее на магнитный держатель и подготовить колонку, пропустив через нее три мельницы максимального буфера. Через нее мы собираемся открыть колонку и разместить ее так, чтобы зубцы были обращены внутрь внутрь магнита. Теперь я собираюсь добавить максимальный буфер в столбец, и вы должны увидеть, как он опускается вниз по столбцу LS и начинает капать внизу. Не беспокойтесь о том, что колонна иссякнет.

Поверхностное натяжение жидкости не даст ей пересохнуть, пока вы не добавите свои ячейки. Прежде чем добавлять ячейки, важно дать максимальному буферу полностью пропитаться через столбец. Итак, после 15-минутной инкубации с нашими магнитными шариками биотина, которые я потратил на клетки и максимальный буфер, я собираюсь слить буфер, снова суспендировать их в буферном количестве, которое соответствует нашему количеству клеток.

Так что вам придется проверить свой протокол milli tiny для этого. А затем я собираюсь нанести их на колонку, которую мы только что промыли максимальным буфером. Итак, теперь мы добавим суспензию ячеек в столбец.

И поскольку это столбец с отрицательным отбором, мы собираемся собрать клетки, которые прошли через него, и все они должны быть CD четырьмя положительными Т-клетками в данном случае. Итак, теперь я собираюсь промыть колонку максимальным буфером 12 мил, и снова мы собираем элюирование, которое должно содержать только четыре CD положительных Т-клеток. Итак, теперь я собираюсь раскрутить четыре CD-положительные Т-клетки, ресуспендировать их, а затем пометить соответствующим красителем, который я собираюсь использовать для тау-визуализации.

Я также возьму небольшую выборку клеток, которые я очистил, и помечу их анти-CD-3 и анти-CD-4, а затем проверю их на основе фактов, чтобы убедиться, что у меня есть чистая популяция CD-4-положительных Т-клеток. Итак, вот взгляд на клетки, которые мы только что раскрутили. Это должна быть популяция чистых CD 3, CD 4 положительных Т-клеток.

Итак, я только что показал вам отрицательный отбор для CD четырех положительных Т-клеток. Используя крошечный биотехнологический набор Milit, мы собираемся перенести эти клетки в мышь и использовать ее для одного из наших собственных Т-фотонных и машинных экспериментов. Удачи вам в собственных экспериментах.