Выделение CD4 + Т-клеток от мышей лимфатических узлов с помощью Miltenyi MACS очистки

Это магнит Max MIDI. На нем указано: «Осторожно, чрезвычайно сильные магнитные поля». Здравствуйте, я Мелани Мэтью из лаборатории Майка Коллинза кафедры физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне.

Сегодня мы продемонстрируем подготовку CD4-положительных Т-клеток методом негативной селекции с использованием наборов Milton Biotechnology. Перед нами системы Minimax и Mini-max; магниты Minimax и Mini-max. Системы Minimax используются для разделения больших объемов: через колонку, подходящую для Minimax, можно пропустить до 10⁹ клеток, тогда как Mini-max предназначены для гораздо меньших объемов клеток.

Таким образом, в зависимости от того, проводите ли вы положительную или отрицательную сепарацию, вы маркируете клетки соответствующими антителами. К антителам прикреплены магнитные частицы, которые связываются с магнитом. В случае отрицательного отбора интересующие вас клетки пройдут сквозь колонку, и вы сможете собрать элюат, содержащий искомые клетки.

Я должен отметить, что методы, которые я демонстрирую вам сегодня, не являются стерильными. Поэтому, если вы планируете использовать эти клетки для культивирования, все манипуляции следует проводить в ламинарном шкафу для культур тканей с использованием стерильных инструментов. Таким образом, несмотря на то, что я показываю процесс подготовки CD4-положительных T-клеток, многие из этих методов применимы для очистки других типов клеток с использованием наборов Miltenyi Biotec.

Итак, я извлек лимфатические узлы из мыши; подробно этот процесс показан в седьмом выпуске JoVE «Подготовка лимфатических узлов для двухфотонной визуализации». Теперь я перетру лимфатические узлы до получения суспензии из одиночных клеток с помощью клеточного фильтра с размером пор 70 мкм. Теперь я перетру лимфатические узлы в суспензию из одиночных клеток, используя поршень шприца объемом 6 мл.

Лимфатические узлы находятся в среде RPMI внутри фильтра; важно получить качественную суспензию одиночных клеток. Мы используем фильтр для того, чтобы убедиться в отсутствии агрегатов клеток. После завершения растирания я извлеку фильтр из среды, и затем буду использовать прошедший через сито осадок, представляющий собой суспензию одиночных клеток.

При растирании необходимо максимально тщательно измельчить всю ткань. Полученная суспензия одиночных клеток будет использована нами для очистки CD4-положительных Т-лимфоцитов. Итак, растирание ткани завершено, и, как видно, большая часть лимфатических узлов практически полностью разрушена.

Здесь все еще остались небольшие фрагменты жира и своего рода капсулы лимфатических узлов с небольшим количеством соединительной ткани, которые слиплись из всех шести лимфатических узлов. Теперь я вынимаю клеточный фильтр. Вы можете видеть, что среда стала очень мутной.

Пробирка заполнена суспензией одиночных клеток, чтобы обеспечить максимальный выход клеток с фильтра, так как некоторые из них могут прилипнуть к нему. Я промываю фильтр несколькими миллилитрами среды, затем переношу всю среду в 15-миллилитровую пробирку Falcon и центрифугирую ее для получения осадка клеток с целью дальнейшей очистки. Таким образом, я получил суспензию одиночных клеток, центрифугированную до получения осадка при 300 G в течение 10 минут.

Если вы предполагаете, что в вашей суспензии одиночных клеток будет высокая доля мертвых клеток, рекомендуется использовать набор для удаления мертвых клеток от Miltenyi Biotec. Теперь, когда я получил осадок, я слью среду и проведу лизис эритроцитов, после чего посчитаю клетки и выполню отрицательную селекцию CD4-положительных Т-клеток для данной группы клеток. Итак, теперь я приступаю к лизису эритроцитов.

Мы собираемся лизировать эритроциты, которые осадили вместе с лимфоцитами, путем снижения осмолярности раствора: сначала мы добавим воду, а затем снова доведем концентрацию до 1x, добавив 10X DPBS. Лимфоциты более устойчивы к изменению осмолярности, чем эритроциты, однако нам все равно нужно действовать быстро, чтобы избежать лизиса лимфоцитов, чего мы хотим избежать. Чтобы ускорить процесс, я заранее подготовлю объемы растворов, необходимые для лизиса, прежде чем фактически добавлять воду в систему.

Таким образом, я хочу добавить 10 X-D-B-P-S через несколько секунд после добавления воды, чтобы убедиться, что лимфоциты не лизируются, в то время как эритроциты подвергаются лизису. Для этого я беру 900 µl воды (почти 1 ml) и 100 µl 10 X-D-B-P-S.

У меня готовы обе пробирки. При лизисе я добавляю воду, жду несколько секунд, возможно, слегка встряхиваю пробирку, затем добавляю 10 X-D-B-P-S и снова немного встряхиваю пробирку. Если вы подвергаете лизису большое количество эритроцитов, вы заметите образование крупного аморфного сгустка из всех разрушенных клеточных мембран.

Здесь у нас есть небольшое количество материала, и вы видите, что это фрагменты разрушенных клеточных мембран. После проведения лизиса, на случай ошибки при пипетировании, я предпочитаю добавить несколько миллилитров среды к клеткам, чтобы обеспечить правильную осмолярность и предотвратить дальнейший лизис. Теперь у меня есть суспензия лимфоцитов из одиночных клеток.

Снова: я провел лизис эритроцитов, теперь я центрифугирую клетки для получения осадка. Перед этим я посчитаю их с помощью гемоцитометра, чтобы определить количество антител, необходимое для набора негативной селекции CD4-положительных Т-клеток. Итак, теперь я центрифугирую клетки в буфере Max, и можно заметить, что после лизиса эритроцитов осадок стал гораздо более белым.

Теперь я проведу негативную селекцию CD4-положительных T-клеток. Для этого я удалю всю среду, весь буфер MACS, в котором центрифугировали клетки. Затем я проведу маркировку с помощью коктейля антител с биотином, что является первым этапом негативной селекции CD4-положительных T-клеток.

Затем я инкубирую их в холодильнике в течение 10 минут. Итак, первичная инкубация клеток завершена. Теперь я добавлю антибиотик к микросферам и снова помещу их в холодильник на 15 минут.

Для данного разделения клеток мы используем колонку LS от Miltenyi Biotec. Мы закрепим ее на магнитном держателе и подготовим колонку, пропустив через нее 3 mL буфера MACS. Откройте колонку и установите ее так, чтобы зубцы были направлены внутрь магнита. Теперь я добавлю буфер MACS в колонку; вы увидите, как он проходит через колонку LS и начинает капать снизу. Не беспокойтесь о том, что колонка может пересохнуть.

Поверхностное натяжение жидкости предотвратит ее высыхание до тех пор, пока вы не добавите клетки. Перед добавлением клеток важно дождаться, пока буфер MAC полностью пройдет через колонку. Итак, после 15-минутной инкубации клеток в буфере MAC с магнитными бисерами, конъюгированными с биотином, я слью буфер и вновь суспендирую клетки в объеме буфера, соответствующем количеству клеток.

Поэтому вам следует проверить ваш протокол для Mini-TINY. После этого я нанесу их на колонку, которую мы только что промыли буфером Max. Теперь мы добавим суспензию клеток в колонку.

Поскольку это колонка для негативной селекции, мы собираем клетки, прошедшие сквозь нее; в данном случае это должны быть только CD4-положительные Т-клетки. Теперь я промою колонку 12 мл буфера MAC, снова собирая элюат, который должен содержать только CD4-положительные Т-клетки. Затем я центрифугирую CD4-положительные Т-клетки, ресуспендирую их и маркирую соответствующим красителем, который я буду использовать для визуализации tau.

Я также возьму небольшой образец очищенных клеток, помечу их антителами к CD3 и CD4 и проанализирую на FACS, чтобы убедиться в получении чистой популяции CD4-положительных Т-клеток. Перед нами клетки, которые мы только что центрифугировали. Это должна быть популяция чистых CD3+ CD4+ Т-клеток.

Таким образом, я продемонстрировал вам метод негативной селекции CD4-положительных T-клеток. Используя набор Miltenyi Biotec, мы проведем адаптивный перенос этих клеток в мышь для проведения наших собственных экспериментов с использованием T-фотонного микроскопа. Желаю успехов в ваших собственных исследованиях.