Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя

Общая цель данной процедуры заключается в анализе кинетики фенотипа, генерации и количества Т-клеток, продуцируемых прогениторами, заселяющими тимус на стадиях E 13 или E 18. Это достигается путем первоначального выделения долей тимуса из эмбрионов мыши на стадиях E 13, E 14 и E 18. На втором этапе доли тимуса E 14 облучают, а затем колонизируют клетками E 13 или E 18, отобранными методом проточной сортировки, в течение 48 часов в висячей капле.

На заключительном этапе колонизированные доли пересаживают под капсулу почки взрослых мышей с нокаутом CD3. В конечном итоге для оценки присутствия потомства тимусных поселяющихся клеток-предшественников E 13 и E 18 в крови химерных животных можно использовать проточную цитометрию. Основным преимуществом данного метода по сравнению с нашими существующими методами, такими как культура Т-клеток in vitro на фибробластах, является то, что данный подход сочетает в себе методы, позволяющие обеспечить полное созревание Т-клеток из определенных предшественников в трехмерном анализе, с пересадкой культур органов тимуса в интактных мышей-реципиентов, что позволяет оценить дифференцировку и функцию предшественников тимусных срезов и их потомства.

В качестве инженера-исследователя с опытом проведения хирургических операций на грызунах, я продемонстрирую процедуру. За два дня до эксперимента по трансплантации в ламинарном шкафу обработайте живот беременной самки мыши 70% ethanol и сделайте продольный разрез кожи по средней линии; раздвиньте края кожи, чтобы открыть разрез, затем с помощью пинцета и ножниц вскройте брюшину, не касаясь пищеварительного тракта. Далее извлеките раздвоенную матку и с помощью ножниц отделите ее от влагалища. Затем поместите матку в чашку Петри размером 90 by 15 millimeter, содержащую 40 to 50 milliliters DPBS, и сделайте поперечные разрезы между децидуальными оболочками каждого эмбриона.

С помощью ножниц с тонкими кончиками и тонкого пинцета удалите мышечную оболочку матки, делая разрез между плацентой и желточным мешком, чтобы извлечь каждый эмбрион. Затем удалите амнион, сохранив эмбрионы, и перенесите их в новую чашку Петри с HBSS и 1% FCS. Для изоляции тимуса помещайте эмбрионы по одному в положение на спине под бинокулярной лупой.

Затем введите один пинцет продольно вдоль хряща грудины, после чего зажмите и раскройте грудную клетку с помощью изогнутого пинцета. Отодвиньте грудную стенку в сторону, чтобы визуализировать доли тимуса по обе стороны от трахеи. Затем зажмите ткани под тимусом тонким пинцетом, чтобы аккуратно удалить каждую долю и поместить их в чашку Петри, содержащую 1 mL HBSS с добавлением 1% FCS.

Затем с помощью двух тонких пинцетов удалите окружающую соединительную ткань, не повреждая доли. После этого промойте доли в трех миллилитрах HBSS с добавлением 1% FCS, чтобы удалить эритроциты перед началом культивирования органов фетального тимуса. Доли тимуса эмбрионов E 14, выделенные из эмбрионов CD 45.2, согласно только что продемонстрированному методу.

Оставьте доли покоиться примерно на три часа. Затем центрифугируйте свежеотсортированные предшественники тимуса стадий E 13 или E 18. Ресуспендируйте осадок в культуральной среде до конечной концентрации 500 клеток на 35 µL среды.

Затем нанесите каплю клеточной суспензии объемом 35 µL в каждую вторую лунку 60-луночного планшета Terasaki и поместите одну облученную долю на поверхность каждой капли. Закройте планшет и переверните его вверх дном, чтобы клетки под действием силы тяжести достигли апикального полюса капли, осторожно постучав по верхней стороне перевернутого планшета, чтобы заставить доли соскользнуть к апикальному краю капли. После этого инкубируйте перевернутый планшет в увлажненном инкубаторе в течение 48 часов при 37 °C и 5% CO2.

После колонизации долей тимуса проверьте уровень анестезии животного-реципиента по отсутствию рефлекторного ответа. Затем нанесите каплю глазной мази на каждый глаз и поместите мышь на правый бок под ламинарный поток воздуха. После этого выбрейте область хирургического вмешательства непосредственно над суставом задней конечности.

Затем наденьте пару стерильных перчаток и простерилизуйте операционное поле 70% ethanol и 10% раствором IOD DY DER. С помощью скальпеля сделайте разрез длиной 1,5 сантиметра через кожные ткани, после чего выполните разрез через мышечную ткань. Теперь слегка надавите на обе стороны разреза, чтобы вывести почку из брюшной полости, и поддерживайте почку во влажном состоянии с помощью физиологического раствора.

Удерживайте почку ватной палочкой вне забрюшинного пространства и с помощью двух тонких пинцетов сделайте отверстие диаметром два-три миллиметра в капсуле. Затем, удерживая стенку капсулы открытой, осторожно просуньте до шести трансплантатов долек тимуса к краю полюса почки и верните почку в забрюшинное пространство. Наложите швы на мышцы, а затем на кожу отдельными хирургическими узлами.

Затем смочите рану 10% раствором повидон-йода и поместите мышь на нагревательную подушку с температурой 37 °C, наблюдая за животным и хирургической раной до их полного заживления, чтобы определить наилучший метод истощения эндогенных тимоцитов для развития колонизирующих прогениторов. В данном эксперименте сравнивали уровни восстановления Т-клеток в колонизированной доле тимуса после облучения или пятидневного лечения дезоксигуанозином. Хотя на девятый день культивирования разницы в количестве колонизирующих лимфоцитов не наблюдалось, на 12-й день облученные доли содержали больше Т-клеток, чем доли, подвергшиеся воздействию дезоксигуанозина, что делает облучение предпочтительным методом для стимуляции развития Т-клеток после колонизации тимуса. Для изучения потенциала развития прогениторов, заселяющих тимус на стадиях E 13 и E 18, облученные доли тимуса эмбрионов E 14 колонизировали равным количеством двух типов прогениторов; при этом, как было отмечено, прогениторы, заселяющие тимус на стадии E 13, давали меньше тимоцитов и двойных положительных Т-клеток, чем прогениторы, заселяющие тимус на стадии E 18.

Однако частота зрелых CD3-положительных клеток была повышена, а продукция дендритных эпителиальных Т-клеток обнаруживалась только в потомстве прогениторов тимуса стадии E 13. Для анализа потенциала прогениторов тимуса стадий E 13 и E 18 in vivo тимусные доли, колонизированные каждым типом прогениторов, были трансплантированы под капсулу почки реципиентов с нокаутом CD3. Как было только что продемонстрировано, и согласно ожиданиям, прогениторы тимуса стадии E 13 давали начало Т-клеткам быстрее, чем прогениторы стадии E 18, хотя общее число циркулирующих Т-клеток в животных, колонизированных прогениторами тимуса стадии E 13, было значительно ниже. После своего развития этот метод открыл исследователям в области иммунологии развития путь к изучению свойств субпопуляций Т-клеток, некоторые из которых имеют строго эмбриональное происхождение в модели млекопитающих.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проследить дифференциальные и функциональные пути прогениторов оседающих клеток Timex и их потомства как в естественной среде, так и в условиях конкуренции.