Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя В Vivo И In Vitro Анализы

Общая цель этой процедуры заключается в анализе кинетики фенотипа генерации и количества Т-клеток, продуцируемых предшественниками тимуса E 13 или E 18. Это достигается путем выделения долей тимуса из эмбрионов мышей E 13, E 14 и E 18. На втором этапе доли тимуса Е 14 облучают, а затем колонизируют отсортированными током клетками Е 13 или Е 18 в течение 48 часов в висячей капле.

На заключительном этапе колонизированные доли прививаются под почечную капсулу взрослых мышей с нокаутом CD three. В конечном счете, проточная цитометрия может быть использована для оценки присутствия в крови химерных животных предшественников E 13 и E 18, оседающих в тимусе. Основное преимущество этой методики по сравнению с нашими существующими методами, как и культура Т-клеток in vitro на клетках in-so, заключается в том, что эта методика сочетает в себе методы, которые обеспечивают полное созревание Т-клеток от определенных предшественников в трехмерном анализе с трансплантацией культур органов тимуса у интактных мышей-реципиентов, что позволяет оценить дифференцировку и функцию предшественников слайсов тимуса и потомства.

За два дня до эксперимента по пересадке в капюшон с ламинарным потоком я продемонстрирую процедуру в брюшной полости беременной самки мыши с 70% этанолом и сделать продольный разрез на коже по средней линии, раздвинуть кожу, чтобы открыть разрез, а затем с помощью щипцов и ножниц открыть брюшину, не касаясь пищеварительного тракта. Далее вытащите раздвоенную матку и с помощью ножниц отделите ее от влагалища. Затем поместите матку в чашку Петри размером 90 на 15 миллиметров, содержащую от 40 до 50 миллилитров DPBS, и разрежьте поперечно между децидуальными отверстиями каждого эмбриона.

С помощью ножниц с тонким кончиком и тонких щипцов удалите мышечную оболочку матки, разрезая ее между плацентой и желточным мешком, чтобы извлечь каждый эмбрион. Затем удалите амнио, удерживающий эмбрионы, и поместите эмбрионы в новую чашку Петри, содержащую HBSS плюс 1% FCS. Чтобы изолировать тимус, поместите эмбрионы по одному в положение лежа на спине под бинокулярную увеличительную линзу.

Затем введите один щипцы в продольном направлении вдоль хряща грудины и защипните и раскройте грудную сетку с помощью изогнутых щипцов. Отведите грудную стенку в сторону, чтобы визуализировать доли тимуса с каждой стороны трахеи. Затем защипните под тимусом с помощью тонких щипцов, чтобы аккуратно удалить каждую долю и поместить их в чашку Петри, содержащую один миллилитр HBSS плюс 1% FCS.

Далее с помощью двух тонких щипцов удалите окружающую соединительную ткань, не повреждая мочки. Затем промойте доли в трех миллилитрах HBSS плюс 1% FCS, чтобы устранить эритроциты, чтобы начать облучение плода культурой органов тимуса. Доли тимуса E 14, выделенные из эмбрионов CD 45.2, как только что продемонстрировано.

Дайте долям отдохнуть около трех часов. Затем раскрутите вниз только что отсортированные Е 13 или Е 18 тимических отсаживающихся прародителей. Повторно суспендировать гранулу в питательной среде до конечной концентрации 500 клеток на 35 микролитров среды.

Затем поместите 35 микролитровую каплю клеточной суспензии в каждую вторую лунку 60-луночного планшета терасаки и положите одну облученную долю на поверхность каждой капли. Закройте пластину и переверните ее вверх дном, чтобы клетки достигли апикального полюса капли под действием силы тяжести, осторожно ударяя по верхней стороне перевернутой пластины, чтобы заставить доли соскользнуть к апикальному краю капли. Затем инкубируйте перевернутую пластину в увлажненном инкубаторе в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После того, как доли тимуса были колонизированы, проверьте уровень анестезии животного-реципиента по отсутствию рефлекторной реакции. Затем нанесите каплю глазной мази на каждый глаз и положите мышь на правый бок под ламинарный капюшон. Затем побрейте операционную область чуть выше сустава задней ноги.

Затем сделайте пару стерильных перчаток и простерилизуйте операционное поле с помощью 70% этанола и 10% раствора IOD DY DER. С помощью скальпеля сделайте 1,5-сантиметровый разрез через кожную ткань, с последующим разрезом через мышечную ткань. Теперь слегка надавите на обе стороны разреза, чтобы вытолкнуть почку из брюшной полости и поддерживать почку влажной с помощью физиологического раствора.

Поддерживайте почку ватной палочкой за пределами забрюшинной полости и с помощью двух тонких щипцов сделайте двух-трехмиллиметровое отверстие в капсуле. Затем, держа стенку капсулы открытой, осторожно сдвиньте до шести трансплантатов доли тимуса под ближе к краю полюса почки и поместите почку обратно в забрюшинную полость. Сшивание мышцы при неврозе с последующим наложением кожного шва с индивидуальными хирургическими узлами.

Затем смочите рану 10% йодидным раствором повидона и положите мышь на грелку с температурой 37 градусов Цельсия, наблюдая за животной и хирургической раной до тех пор, пока они полностью не выздоровеют, чтобы определить наилучший метод истощения эндогенных тимоцитов для развития колонизирующих предшественников. В этом эксперименте сравнивались уровни восстановления Т-клеток в колонизированной доле тимуса после облучения или пятидневного лечения дезоксигвинией. Несмотря на то, что на девятый день культивирования не было обнаружено никакой разницы в количестве колонизирующих лимфоцитов, облученные доли содержали больше Т-клеток, чем те, которые были обработаны дезоксигиной на 12-й день, что делает облучение предпочтительным методом лечения для облегчения развития Т-клеток после колонизации тимуса для изучения потенциала развития предшественников тимуса E 13 и E 18 здесь. Облученные доли тимуса E 14 были колонизированы равным числом предшественников двух типов, как наблюдалось, оседающие предшественники тимуса E 13 дали начало меньшему количеству тимоцитов и двойным положительным Т-клеткам, чем предшественники E 18 тимуса.

Однако частота зрелых CD трех положительных клеток была увеличена, и продукция дендритных эпителиальных Т-клеток была обнаружена только в потомстве предшественников тимуса E 13 для анализа in vivo потенциала предшественников тимуса E 13 и E 18 доли тимуса, колонизированные каждым типом предшественников, были привиты под почечную капсулу реципиентов CD 3 с нокаутом. Как только и продемонстрировано, как и ожидалось. Предшественники E 13 тимуса давали начало Т-клеткам быстрее, чем предшественники E 18, хотя количество циркулирующих Т-клеток было значительно ниже у колонизированных животных E 13. Некоторые из них имеют строгое эмбриональное происхождение в модели млекопитающих.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проследить дифференциальные и функциональные пути расселения прародителей Timex и их потомства даже в естественной среде и конкурентных условиях.