Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Hi.In этом видео мы представляем полный эксперимент по квантовому слежению. Специальный алгоритм был полностью разработан в сотрудничестве с экспертами по имиджу ИГИЛ. В этом видео мы будем использовать рецептор эпидермального фактора роста в качестве модели для описания метода этой техники.

Рецептор эпидермального фактора роста представляет собой трансмембранный белок. Этот рецептор будет помечен с помощью моноклонального антитела, которое восстанавливается, чтобы сохранить только фрагмент А и В. Фрагмент A a B биотинилируется, и после этого, связанный со стрептавидином квантовой точки, система стенок будет точно распознавать рецептор EGF.

Наша цель состоит в том, чтобы дать всестороннее представление о динамике рецепторов клеточной поверхности. Действительно, молекулярные траектории могут отклоняться от диффузии brot, будучи ограниченными нанодоменами. Например, и это может быть сигнатурой основного взаимодействия, например, с сигнальными партнерами или молекулярными каркасами.

Мы стремимся исчерпывающе описать такие события, сопоставляя их по ячейке, что требует работы с высоким временным разрешением ОФЭКТ в сочетании с высокой плотностью мечения. Поэтому мы называем этот подход многоцелевой трассировкой. Первым этапом эксперимента является подготовка образца.

Мы работаем на живых клетках без антибиотиков. Здесь мы используем стоимость семи клеток, которые эндогенно экспрессируют рецепторы EGF. После отделения ячейки нам нужно точно подтвердить, чтобы иметь такое же количество клеток в ячейке лаборатории.

Точное количество клеток очень важно для повышения предсказуемости количества квантовых точек на клетку После дозирования клетки в H, вам нужно инкубировать лабат в течение 24 часов при температуре 37 градусов с 7% CO2. Следующим этапом является получение квантовой точки, связанной с антителами. Квантовые точки — это маленькие флуоресцентные наночастицы.

Эти частицы представляют здесь очень большой интерес, потому что они очень яркие и стабильные по сравнению с классическими флуоресцентными зондами и сигналами. Соотношение носа очень важно для такого рода экспериментов. В этом случае мы используем полную среду для насыщения полосок вокруг квантовых точек и предотвращения агрегации.

После этого у нас были квантовые точки в белке биоTE или антителах, представляющих интерес, с соотношением один к одному, чтобы иметь статистически более одновалентные квантовые точки. В этом эксперименте мы используем b-фрагмент против рецептора EGF, полученного в лаборатории из моноклональных антител, на которые нацелен биотин. Во время инкубации около 15 минут вы можете поддерживать контроль над агрегацией и однородностью с помощью шейкера со скоростью 1 200 оборотов в минуту и двумя пятью градусами.

Когда смесь будет готова, вы можете добавлять ее на свои ячейки. Извлеките среду из лунки очень осторожно, чтобы предотвратить отслоение клеток на лабораторной технике, и добавьте необходимое количество смеси для вашего эксперимента. В этом случае мы добавим 100 микролитров смеси на лунку.

После добавления смеси вы можете инкубировать свою клетку в течение 15 минут. В данном случае при 37 градусах с 7%СО2. После этой инкубации вы можете обнаружить большое количество частых двойных точек во взвешенном состоянии на среде.

Эти квантовые точки должны быть удалены перед получением изображения. Из-за шума, который мы приносим. Вот почему нам нужно помыть каждую, ну, в данном случае несколько раз, пять раз, чтобы помыться.

Используйте носитель изображения с неавтофлуоресценцией. Здесь мы используем буфер HBSS с aps. Теперь ваши клетки готовы.

Самое время перейти к настройке для приобретения. Установка состоит из четырех основных частей: инвертированного микроскопа, камеры с чувствительностью глаз, мощной ртутной лампы и инкубатора для поддержания температуры камеры при температуре 37 градусов. Свет от ртутной лампы проходит через волокно и через фильтрующее колесо перед освещением образца.

Тест на грипп eSense образца фильтруется и собирается камерой E-M-C-C-D слева. В настоящее время мы используем 1.3 и 1.49 с числовой апертурой масла для торговцев объективами. Центральным этапом этого эксперимента является приобретение само по себе.

После того, как клетки оказались в фокусе, мы смотрим на репрезентативную с яркой меткой. В квантовых точках мы сначала получаем одно изображение в проходящем белом свете, которое в дальнейшем может быть использовано для проверки аспекта клетки и специального предела подия LA. Затем мы получаем видео обычно с частотой 36 миллисекунд, что является самым высоким показателем, допустимым для полного кадра.

Мы используем ПЗС-матрицу, умножающую электроны, чтобы достичь чувствительности одной молекулы с достаточным отношением сигнал/север не менее 20 децибел. Обычно около 25 децибел, мы обычно приобретаем 300 кадров. Чтобы оценить данный набор данных, вам нужно только предоставить пропуск в директорию, содержащую видеофайлы.

Затем, после ввода команды, текст снова подключается в MetLab или команду MTT 23 I, которая сначала отображает список графических интерфейсов. Все используемые параметры начнут полностью автоматизированный анализ. Основной анализ MTT выполняется для каждого кадра, вызывая три основные задачи, сначала обнаруживая для каждого пикселя наличие или отсутствие целевого квантового долга.

Затем для каждого обнаружения цели оцениваются соответствующие параметры, такие как ее положение пикселя, интенсивность сигнала и так далее. Последнее переподключение новых целей. С уже построенными следами поверх предыдущих кадров для каждого пикселя.

Рассматривая локальный субрегион, мы сравниваем наличие двух гипотез, либо только шума, либо сигнала. Благодаря функции спреда точки ModuLite имеет пик hin. Мы используем порог, обеспечивающий достаточно низкий уровень ложных срабатываний с менее чем одним прохождением на кадр для каждой обнаруженной цели.

Затем мы выполняем метод наименьшего квадрата по призрачным питательным футам, чтобы оценить положение, ширину и высоту обнаруженного гошена. Это в значительной степени обеспечивает положение ячейки SPIC красителя, обычно с точностью от 10 до 20 нанометров, поскольку типичное отношение сигнал/шум на пиках высокой плотности часто может быть слишком закрытым, и сильные пики могут мешать самым слабым с этим справиться. Мы сдуваем обнаруженные пики из исходного прогона изображения.

Опять же, обнаружение остаточных значений обычно может привести к перекосу на 10% от пиков. Достижение почти полного обнаружения очень полезно для точного повторного подключения. Затем набор новых целей сопоставляется с набором предыдущих следов для данного зрачка.

Для того, чтобы по возможности привязать каждую трассу к цели и справиться с возможным миганием, мы используем всю доступную статистическую информацию, полученную на этапе обнаружения. Следовательно, цели не просто назначаются ближайшей трассе. В случае конфликтов, когда трассы могут пересекаться, то есть соответствующие релевантные области исследования перекрываются, мы будем учитывать статистическое значение интенсивности, скорости, ширины и мигания как для трасс, так и для целей.

Это обеспечивает статистически оптимальную оценку повторного подключения. Эта стратегия позволяет по возможности избегать смещения перезамыкания в сторону ближайших соседей, то есть самого медленного движения. Далее мы используем функцию для оценки возможного переходного удержания в пределах траекторий.

Эта функция обратно пропорциональна локальной диффузии, установленной Секстоном Симпсоном и его сотрудниками. Применение порога позволяет определить ограниченные или неограниченные эпизоды. Повторяя эти общие трассы, мы можем, наконец, отобразить динамику мембраны в терминах временного удержания, признаков замедления, и это может быть представлено.

В качестве альтернативы, используя двоичные или дискретные значения этого индекса удержания, MTT по умолчанию будет автоматически выполнять эти задачи, сохраняя для каждого видео параметры строки для каждого пика в файле eski, а также для дальнейших расширенных исследований. Типичные результаты, такие как карта следов по каждой ячейке и гистограммы для интересующих параметров, пиковых интенсивностей, отношения сигнал/шум, значений локального дефицита, и поэтому этот аспект также может быть легко адаптирован к любому специальному исследованию. В этом видео теперь будут обобщены типичные результаты, полученные с помощью MTT.

Значительная часть работы заключается в разработке алгоритма, который, возможно, потребуется адаптировать к специализированным исследованиям, таким как страдание при движении или взаимодействиях. Но запустить MTT очень просто. Пользователи должны оптимизировать только несколько параметров, таких как ограничения по пространству и времени.

При разработке МТТ мы стремились полностью переосмыслить аналитические варианты, используемые для каждой задачи. Мы оптимизируем процесс по двум сложным направлениям. Во-первых, работа с высокими плотностями для получения наилучшей специальной информации на поверхности поверхности, а во-вторых, работа со слабым отношением сигнал/шум, которое обычно позволяет работать с низким уровнем исключения и высокой скоростью удержания, может быть интерпретировано как сигнатура основного взаимодействия.

Мембранные рецепторы могут взаимодействовать, например, с субмембранным цитоскелетом или пролипидными доменами. Такие события могут быть исследованы с помощью вариаций в пространстве и времени. Динамические меры можно сравнивать с дополнительными подходами, такими как ОЛР, Ф, С или грузоперевозки.

Открытый исходный код доступен для академических исследований. Его можно скачать с нашей веб-страницы по адресу CML dot univ, если есть S fr на странице наших команд, которая предоставляет ссылку для скачивания. Заинтересованные промышленные предприятия также могут связаться с нами.

Мы хотели бы выразить особую благодарность членам нашей команды и коллективу за поддержку и плодотворные дискуссии. Этот проект поддерживается финансированием со стороны CNRS в c MAA University Pac Region National de La, а Foundation Medical поддерживается контролером лиги. Спасибо за просмотр.