Соотнося геноспецифических метилирования ДНК изменения с выражением и транскрипционной активности астроцитарных

Общая цель данной процедуры заключается в оценке статуса метилирования ДНК гена KCNJ 10 в обогащенной популяции астроцитов и корреляции изменений метилирования промотора с его транскрипционной активностью. Это достигается путем первоначального выделения обогащенной популяции кортикальных астроцитов из целого мозга грызуна с помощью сортировки по признакам (FACS), после чего из полученной популяции астроцитов выделяется ДНК. Затем статус метилирования ДНК KCNJ 10 оценивается с помощью высокоразрешающего анализа плавления, чувствительного к метилированию, или MS.HRMA.

Наконец, промотор KCNJ 10 гиперметилирован, и для корреляции изменений метилирования ДНК промотора с транскрипционной активностью используется люциферазный анализ. В конечном итоге MS-HRMA и люциферазный анализ применяются для определения статуса метилирования ДНК KCNJ 10 и установления взаимосвязи между изменениями метилирования промотора и транскрипционной активностью гена. Будет продемонстрирована соответствующая процедура. Процедуру выполняет постдокторант моей лаборатории. Все животные содержались и использовались в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения; использование животных было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Университета Алабамы в Бирмингеме.

Все буферы и реагенты были приготовлены согласно текстовому протоколу. После выделения коры из головы эвтаназированного животного, в соответствии с текстовым протоколом, прорежьте или просверлите гравером отверстие в верхней части конической пробирки объемом 50 миллилитров, чтобы в нее можно было ввести трубки. Затем добавьте в пробирку раствор папаина.

Поместите препарированную кору в чашку для культивирования диаметром 10 мм, содержащую среду для диссоциации, насыщенную 95% O2 и 5% CO2, и с помощью чистого лезвия бритвы измельчите ткань на фрагменты размером 1х1 мм. С помощью пипетки объемом 10 мл перенесите ткань в пробирку объемом 50 мл с раствором пепсина. Перед извлечением из пипетки дайте ткани осесть на дно.

Чтобы минимизировать перенос среды для диссоциации, не подвергая раствор пепаина вспениванию, обеспечьте постоянный поток 95%O2 и 5%CO2 путем поверхностного газообмена при инкубации в водяной бане при 37 °C в течение 20 минут. После инкубации с помощью трансфер-пипетки объемом 10 мл медленно перенесите ткань 10 раз; центрифугируйте мутную клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Уравновесьте раствор ингибитора альбумина ДНК путем поверхностного газообмена и ресуспендируйте осадок клеток в трех миллилитрах этого раствора.

Затем приготовьте коммерческий разрывной градиент плотности в соответствии с инструкциями производителя. Центрифугируйте разрывной градиент плотности при 70 G в течение шести минут. После этого изолируйте диссоциированные клетки со дна пробирки, аспирируя среду с помощью пипетки.

Используйте от двух до трех миллилитров DPBS с 0.02% бычьим сывороточным альбумином и одним миллиграммом на миллилитр ДНК или предпочтительную среду. Для повторного использования суспендируйте диссоциированные клетки. Пропустите клетки через фильтр 40 мкм перед проведением FACS-сортировки и экстракцией ДНК или РНК согласно текстовому протоколу.

После разработки праймеров к последовательности ДНК, подвергнутой бисульфитной конверсии, и амплификации ДНК согласно текстовому протоколу, проведите бисульфитную конверсию 500–1000 нг ДНК каждого образца и стандартов метилированной ДНК с уровнем метилирования от 0% до 100% того же вида животных, используя подходящую ДНК-полимеразу и праймеры в концентрации 5 мкМ. Подготовьте реакционные смеси объемом 20 мкл для Ms HRM амплификации. Согласно данной таблице, проведите анализ всех образцов, включая контрольные образцы ДНК и стандарты метилирования, в трех повторностях; в зависимости от настроек программного обеспечения для анализа, установите параметры начала и окончания (pre- and post-start/stop) вокруг переходов кривой плавления.

Установите параметры начала и окончания предварительного плавления (prem melt start и prem melt stop), чтобы разница между ними составляла 0,2–0,5 °C. Аналогично установите параметры начала и окончания плавления после основного пика (post melt start и stop) и извлеките данные о разности пиковых температур для каждого образца, используя стандарты с известным процентом метилирования и соответствующие им значения разности пиковых температур.

Постройте уравнение линейной регрессии. Используйте данное уравнение линейной регрессии для оценки статуса метилирования неизвестных образцов после идентификации интересующих CpG-островков, а также амплификации и клонирования CpG-островка в плазмиду согласно текстовому протоколу. Используйте программное обеспечение Preferred Cutter для проверки сайтов рестрикции, чтобы избежать двойного расщепления, и линеаризуйте 30 µg плазмиды после того, как образец будет переварен соответствующими ферментами.

Термически инактивируйте ферменты при соответствующей температуре и в течение определенного времени в реакциях объемом 50 µL. Для метилирования используйте пять единиц CPG-метилтрансферазы. 700 µg линеаризованных плазмид при 30 °C в течение от 13 до 19 часов.

После очистки ДНК, как описано в текстовом протоколе, проведите двукратное рестрикционное расщепление образцов метилированной ДНК в количестве 1 µg с помощью фермента HPA II путем инкубации при 37 °C в течение одного часа. После очистки ДНК нанесите образцы на 1% агарозный гель для ДНК и проведите электрофорез при 100 В в течение 45 минут для визуализации. Затем подвергните метилированные и неметилированные плазмиды двойному расщеплению соответствующими рестриктазами в течение ночи для выделения полноразмерного вектора Luke 2 и фрагментов CpG-островков.

После завершения дигестии инактивируйте ферменты путем нагревания. Проведите электрофорез образцов с двойным дигестием в 1% агарозном геле для ДНК при 100 В в течение одного часа для разделения вектора и вставки, затем, используя средства защиты от УФ-излучения, поместите гель в УФ-визуализатор и с помощью чистых скальпелей вырежьте метилированные и неметилированные вставки. После экстракции ДНК из геля в соответствии с текстовым протоколом, используйте T4 ДНК-лигазу и соотношение вектора к вставке от 1 к 4 для лигирования метилированных и неметилированных вставок в неметилированный вектор. После лигирования инкубируйте смесь при -20 °C или на льду в течение ночи.

Очистите ДНК и подтвердите повторное лигирование, прогнав образцы на 1% агарозном геле для ДНК, и определите концентрацию повторно лигированной плазмиды. Расселите клетки CD 54 по 12-луночному планшету с плотностью 140 000 клеток на лунку. Через 24 часа используйте коммерческий реагент для трансфекции, чтобы трансфицировать клетки равными концентрациями либо неметилированной плазмиды CpG loop two вместе с RAN vanilla или другим контрольным люциферазным вектором, либо метилированной плазмиды CpG loop two вместе с ELLA или другим контрольным люциферазным вектором. Инкубируйте клетки в течение 24 часов после трансфекции перед проведением люциферазного анализа.

В соответствии с инструкциями производителя используйте люминометр для считывания показателей каждой лунки в трех повторностях. Рассчитайте отношение активности люциферазы светлячка к активности ran vanilla или другого контроля. Активность люциферазы.

Нормализуйте активность метилированной контрольной люциферазы светлячка по отношению к активности неметилированной контрольной люциферазы светлячка, разделив активность метилированной формы на активность неметилированной люциферазы. Как показано здесь, обогащенная популяция астроцитов была получена путем FACS-сортировки трансгенных животных E-G-F-P-S 100 beta. Целевая популяция отбиралась на основе прямого и бокового светорассеяния, а популяция живых клеток определялась с помощью индикатора мертвых клеток на основе бромида; представленные здесь гейты являются репрезентативными изображениями EGFP-положительных астроцитов после диссоциации, но до сортировки, а также после сортировки. На данном рисунке показана изолированная популяция EGFP-положительных клеток, в которой наблюдалось 40-кратное увеличение уровня мРНК астроцит-специфического маркера.

LDH 1:1. Кроме того, несмотря на совместную экспрессию S100β и NG2 в OPC и астроцитах, наблюдалось четырехкратное снижение уровня мРНК NG2, маркера клеток-предшественников олигодендроцитов, что свидетельствует об изоляции обогащенной популяции астроцитов. В данной таблице приведены данные об общем количестве РНК и ДНК, выделенных из животных разного возраста и в разном количестве; таблица служит справочником для оценки ожидаемого выхода молекул после проведения анализа.

Наконец, для оценки транскрипционной активности гиперметилированных участков исследуемого гена после переноса метилированной вставки в неметилированный вектор был использован метод двойного люциферазного анализа. Для проверки статуса метилирования плазмиды применялся фермент HPA II, который расщепляет только неметилированную ДНК. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать обогащенную популяцию астроцитов с помощью FACS, а также о том, как измерить метилирование ДНК гена и сопоставить изменения метилирования промотора с транскрипционной активностью, используя соответственно анализ плавления высокого разрешения, чувствительный к метилированию, и люциферазный анализ.