Соотнося геноспецифических метилирования ДНК изменения с выражением и транскрипционной активности астроцитарных KCNJ10 (Kir4.1)

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить статус метилирования ДНК KCNJ 10 в обогащенной популяции астроцитов и соотнести изменения метилирования ДНК промотора с транскрипционной опциональной активностью. Это достигается путем выделения обогащенной популяции кортикальных астроцитов из всего мозга грызуна с помощью сортировки фактов, а затем выделяется ДНК из обогащенной популяции астроцитов. Затем оценивается статус метилирования ДНК KC J 10 с помощью чувствительного к метилированию анализа расплава с высоким разрешением или MS. HRMA.

Наконец, промотор KC J 10 гиперметилирован, и анализ люциферов используется для корреляции изменений в метилировании ДНК промотора с транскрипционной активностью. В конечном счете, MS. HRMA и анализ люциферазы используются для измерения статуса метилирования ДНК KCNJ 10 и коррелируют изменения в метилировании промотора и транскрипционной активности гена. Все животные обрабатывались в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения, Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Алабамы в Бирмингеме

Все буферы и реагенты были подготовлены в соответствии с текстовым протоколом. После вскрытия коры головного мозга у усыпленного животного, согласно текстовому протоколу, вырежьте или удалите отверстие в верхней части конической трубки объемом 50 миллилитров, чтобы можно было ввести трубку в трубку. Затем добавьте в тюбик раствор папина.

Поместите расчлененные коры головного мозга в 10-миллиметровую чашку для культур, содержащую диссоциативную среду, сбалансированную до 95% O2 до 5% CO2, и с помощью чистого лезвия бритвы измельчите ткань на один за другим квадратные миллиметровые кусочки. С помощью пипетки объемом 10 миллилитров мужчины переносят ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую раствор пепана. Перед выпиской дайте салфетке осесть на дно пипетки для переноса.

Чтобы свести к минимуму количество диссоциативной среды, переносимой без барботирования раствора пепана, подайте постоянный поток от 95% O2 до 5% CO2 за счет поверхностного газообмена во время инкубации на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. После инкубации с помощью пипетки для переноса объемом 10 миллилитров медленно тируйте ткань 10 раз, центрифугируйте мутную клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Уравновесьте раствор ингибитора альбумина в ДНК с помощью поверхностного газообмена и ресуспендируйте гранулированные клетки в трех миллилитрах раствора.

Затем приготовьте коммерческий прерывистый градиент плотности в соответствии с инструкциями производителя. Вращайте прерывистый градиент плотности при 70 G в течение шести минут. Затем изолируйте диссоциированные клетки со дна пробирки с помощью пипетки для отсасывания среды.

Используйте два-три миллилитра DPBS с 0,02% бычьего сывороточного альбумина и один миллиграмм на миллилитр ДНК или предпочитаемой среды. Чтобы восстановить клетки, приостановите диссоциированные клетки. Пропустите клетки через фильтр 40 мкг перед проведением сортировки фактов и выделением ДНК или РНК в соответствии с текстовым протоколом.

После разработки праймеров против бисульфитной преобразованной последовательности ДНК и амплификации ДНК в соответствии с текстовым протоколом с помощью сульфита преобразуйте от 500 до 1000 нанограммов ДНК каждого образца и метилированных стандартов ДНК в диапазоне от нуля до 100% от того же вида животных с использованием предпочтительной ДНК-полимеразы и пяти микромолярных праймеров. Настройте реакции на 20 микролитров для амплификации Ms HRM. Согласно этой таблице, запустите все образцы, включая факс, ДНК и метилированные стандарты, в трех экземплярах в зависимости от набора программного обеспечения для анализа, параметров до и после запуска и остановки вокруг переходов кривой плавления.

Задайте параметры prem melt, start и prem melt stop. Таким образом, разница между ними составляет от 0,2 до 0,5 градуса по Цельсию. Аналогичным образом настройте параметры после плавления, запуска и остановки и извлеките данные о разнице пиковых температур для каждого образца, используя стандарты метилирования в процентах и соответствующие им разности пиковых температур.

Создание уравнения линейной регрессии. Используйте это уравнение линейной регрессии для оценки статуса метилирования неизвестных образцов после идентификации островков CPG, представляющих интерес, а также амплификации и клонирования острова CPG Luke two в соответствии с текстовым протоколом. Используйте предпочитаемое программное обеспечение для резака для проверки мест для рестрикционного расщепления, чтобы избежать двойных разрезов, и линеаризируйте 30 микрограммов плазмиды после того, как образец был переварен соответствующими ферментами.

Нагревайте инактивирующие ферменты при соответствующей температуре и продолжительности реакции 50 мкл. Используйте пять единиц метилата CPG для метилирования. 700 микрограммов линеаризованных плазмид при 30 градусах Цельсия в течение 13-19 часов.

После очистки ДНК, как указано в текстовом протоколе, проведите рестрикционный анализ HPA на образцах метилированной ДНК в один микрограмм путем инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После очистки ДНК прогоните образцы на 1%агрос, ДНК геле при напряжении 100 вольт в течение 45 минут для визуализации. Далее следует метилированные и неметилированные плазмиды для двойного расщепления соответствующими ферментами рестрикции в течение ночи для высвобождения полноразмерных фрагментов двухвекторного и CPG-острова.

Тепло инактивирует ферменты после пищеварения. Запустите дважды переваренные образцы на 1%-ном геле ДНК агрос при напряжении 100 вольт в течение одного часа, чтобы отделить вектор и вставить, затем, надев защиту от ультрафиолетового излучения, поместите гель на черный свет и с помощью чистых хирургических лезвий, удалите метилированные и неметилированные вставки после извлечения геля из ДНК в соответствии с текстовым протоколом. использовать Т-четыре ДНК-лигазы и соотношение вектора один к четырем для вставки, чтобы отнести метилированные и неметилированные вставки к неметилированному вектору. Инкубируйте при температуре минус 20 градусов Цельсия или на льду в течение ночи после перевязки.

Очистите ДНК и проверьте повторное лигирование, запустив образцы на геле с 1% ДНК и оцените концентрацию религированных плазмидных клеток CD 54 на 12-луночном планшете со скоростью 140 000 клеток на лунку. Через 24 часа. Используйте коммерческий реагент для трансфекции клеток с равными концентрациями либо неметилированной петли CPG, либо двух плазмид плюс ваниль RAN, или другого контрольного вектора, либо метилированного c pg Люка, двух плазмид плюс ELLA, или другого контрольного вектора люциферов. Дайте клеткам провести трансфекцию в течение 24 часов перед проведением анализа люциферов.

Согласно инструкциям производителя, используйте люнометр для считывания показаний каждой лунки в трех экземплярах. Рассчитайте отношение активности светлячков-люцифер к запущенному ванильному или другому контролю. Деятельность Люцифера.

Нормализовать активность метилированной люциферазы контроля светлячков до активности люциферазы контроля неметилированных светлячков путем деления метилированной активности на активность метилированного люциферазы. Как показано здесь, обогащенная популяция астроцитов была получена путем факсимильной сортировки 100 бета-трансгенных животных E-G-F-P-S. На затворенную популяцию нацеливали на основе прямого и бокового рассеяния, а популяцию живых клеток определяли с помощью индикатора мертвых клеток бромида, и показанное здесь является репрезентативным изображением EGFP-положительных астроцитов после диссоциации, но до сортировки, а также после сортировки, на этом рисунке показана изолированная EGFP-положительная клеточная популяция, которая продемонстрировала 40-кратное увеличение мРНК для астроцитарного специфичного маркера.

LDH один L. Кроме того, несмотря на общую экспрессию S 100 бета и двух положительных OPC и астроцитов, наблюдалось четырехкратное снижение маркера NG two mRNA, A для клеток-предшественников олигодендроцитов, что указывает на выделение обогащенной популяции астроцитарных клеток. В этой таблице перечислены общие РНК и ДНК, выделенные от животных разного возраста и количества животных, и приведены в качестве эталона для ожидаемого выхода молекулярных молекул в соответствии с фактами.

Наконец, для оценки транскрипционной активности гиперметилированных участков интересующего гена использовали двойной анализ люциферов после перемещения метилированной вставки в неметилированный вектор. HPA 2, который переваривает только неметилированную ДНК, был использован для проверки статуса метилирования плазмиды. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить обогащенную популяцию астроцитов с помощью фактов, а также как измерить метилирование ДНК гена и соотнести изменения в метилировании ДНК промотора с транскрипционной активностью с помощью чувствительного к метилированию анализа расплава с высоким разрешением и анализа люциферазы соответственно.