Оптимизирован анализ метилирования ДНК и экспрессии генов с малым, Анатомически определенных областях мозга

Общей целью этой процедуры является изучение ДНК. Метилирование и экспрессия генов изменяются при стрессе в раннем возрасте. Это достигается путем предварительного разлучения новорожденных мышей с матерью, чтобы вызвать стресс в раннем возрасте, в качестве второго шага в области мозга, представляющие интерес здесь, ПВН получают путем микродиссекции in loco, а ДНК и РНК выделяются одновременно из одного тканевого удара.

Далее полученную ДНК обрабатывают сульфитом, а интересующую область амплифицируют с помощью бисульфитной ПЦР. Затем он лигируется в вектор и превращается в бактерии. Успешные преобразования идентифицируются по экспрессии маркеров и размеру фрагмента ПЦР.

И, наконец, для оценки статуса метилирования используется бисульфидное секвенирование. Основное преимущество этого рабочего процесса заключается в том, что он позволяет удобно анализировать эпигенетическое программирование в ответ на стимулы окружающей среды. Этот метод может дать представление об эпигенетическом программировании на примере невзгод в раннем возрасте.

Он также может быть применим к другим системам. Везде, где метилирование и экспрессия генов анализируются в высокотканеспецифичной среде и где доступность тканей ограничена, чтобы вызвать стресс в раннем возрасте. Разлучение матерей проводится у детенышей от беременных C 57 черных шести N матерей, чтобы повлиять на разлучение матерей.

Переводите каждый помет в отапливаемую чистую клетку на три часа ежедневно с одного по 10 дней после рождения, не беспокойте щенков контрольной группы. За исключением трехчасового разделения, все пометы остаются с матерями до отлучения от груди на 21-й день после рождения. Затем детенышей размещают в группах соответствующего пола, от трех до пяти мышей в клетке в стандартных условиях содержания, чтобы начать сбор мозговой ткани, мозг мышей извлекают из черепов и немедленно замораживают в сухом льду изоп и хранят при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Когда все будет готово собрать тканевые дырочки, достаньте мозги из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов и положите их на сухой лед. Начните с криосекции мозга на корональные срезы размером 10 микрон от рострального до детского. Закрепите секции на предметных стеклах и высушите их для окрашивания гребня фиолетовым.

Дополнительные предметные стекла могут быть взяты и сохранены при температуре минус 20 градусов для дальнейших анализов, таких как гибридизация in situ two. Когда будете готовы нанести удары, окрасьте предметные стекла гребневым фиолетовым цветом, чтобы определить интересующие структуры мозга. Затем с помощью пробивной иглы сделайте 0,8-миллиметровые пробоины исследуемых областей с помощью локо-микродиссекции.

Пуансоны должны храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Крайне важно, чтобы микропробивка выполнялась стандартизированным образом, поскольку экспрессия генов и метилирование очень специфичны для тканей. Гомогенизируйте пуансоны в 400 микролитрах тиоцианата кадия с помощью пипетки, а затем сделайте вихревой настройку при комнатной температуре.

Затем пропустите полученный лизат через шприц 29 калибра. Несколько раз удар пуансона больше не должен быть виден. Разделите лизат на равные части.

Один для обработки РНК, что должно быть сделано в первую очередь, а другой для обработки ДНК, который может храниться при комнатной температуре до тех пор, пока РНК не будет обработана для очистки РНК из одной 10-го объема ацетата натрия, одного объема аквафенола и половинного объема 24-го объема хлороформа в изоамил ОМЛ вихря. Смесь энергично взбиваем после каждого добавления и инкубируем итоговую смесь на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируйте смесь.

Соберите водную фазу и добавьте в нее равный объем 70% этанола. Использование набора спиновых колонок для РНК. Проведите расщепление ДНК в колонке и промойте РНК в 25 микролитрах воды.

Теперь очистите ДНК с помощью протокола набора, модифицированного для добавления РН и пищеварения, и нагрейте элуцианский буфер и элуцианскую колонку до 70 градусов Цельсия перед их использованием. Для колонок достаточно 10 минут при 70 градусах Цельсия. Наконец, используйте спектрофотометр для определения концентраций ДНК и РНК.

Типичный пунш PVN дает около 600 нанограммов ДНК и около 400 нанограммов RA, около 100 нанограммов РНК для анализа экспрессии генов с помощью количественной ПЦР перед амплификацией сульфитом. Обработайте 200 нанограммов изолированной ДНК с помощью коммерчески доступного набора для амплификации ДНК из метилированных областей. Заказ праймеров, разработанных специально для бисульфитной преобразованной ДНК Оптимальный дизайн праймера в би-ПЦР имеет важное значение, поскольку качество и специфичность ампликона ПЦР определяют успех следующих этапов.

Когда праймеры поступят, определите их оптимальную температуру и температуру на колене с помощью пилотных экспериментов. Используйте два микролитра ДНК, обработанной сульфитом, в качестве матрицы на каждые 25 микролитров. Смесь для ПЦР.

Амплифицируйте смесь, начиная с шестиминутной денатурации при 95 градусах Цельсия, за которой следуют 45–50 циклов амплификации перед заключительным пятиминутным удлинением при 72 градусах Цельсия. Проанализируйте семь микролитров продукта ПЦР с помощью гель-электрофореза Агрос, чтобы убедиться в размере ампликона. Очистите оставшийся продукт ПЦР для последующего лигирования с помощью коммерчески доступного набора для очистки ПЦР.

При получении нежелательных продуктов ПЦР используйте гель-очистку, чтобы выделить продукт, представляющий интерес для данного протокола. Используется коммерческий набор для клонирования. Эффективность клонирования критически зависит от режущей пластины.

Поэтому, если многократно получается небольшое количество рекомбинантных клонов, попробуйте использовать другой вектор клонирования. Настройте реакцию лигирования объемом 10 микролитров с одним микролитром вектора и тремя микролитрами очищенного продукта ПЦР. Смешайте реакцию с помощью пипетирования и инкубируйте ее в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Очистите реакцию лигирования классическим осаждением этанола и преобразуйте бактерии вместе с продуктом. Добавьте один миллилитр предварительно подогретой среды SOB сразу после подачи импульса и перенесите преобразованные бактерии в реакционную трубку. После восстановления бактерий в течение одного часа при 37 градусах Цельсия распределите по 100 микролитров каждой суспензии на пластине с ампициллином LB, покрытой IPTG.

Xal инкубируют пластины в течение ночи, как только колонии могут быть собраны. Настройте 25 микролитровых колонийных ПЦР-реакций в 96-луночном планшете, используя три микролитра 2,5 миллимолярного хлорида магния в каждой реакции. Выберите положительные белые клоны с наконечником для пипетки и перенесите их в смесь для ПЦР с простым погружением.

Начните ПЦР с четырехминутного цикла плавления. Затем следует 10 циклов амплификации при температуре 56 градусов Цельсия. Каждый шаг этих циклов составляет 30 секунд.

Затем уменьшите температуру до 48 градусов по Цельсию еще на 30 циклов усиления. Завершите пятиминутным циклом удлинения. Теперь загрузите по пять микролитров каждого продукта в гель aros и определите реакции, которые содержат вставку нужного размера.

Используйте коммерчески доступный набор для очистки интересующих вас продуктов ПЦР, чтобы их можно было секвенировать с помощью циклического секвенирования с помощью большого терминатора красителей. В 96-луночный планшет загружают лунки тремя микролитрами большой мастер-смеси для реакции DI, а затем двумя микролитрами очищенного продукта ПЦР с колонией. Запустите реакцию на термоамплификаторе, начиная с одной минуты при 96 градусах Цельсия, затем 35 циклов по 10 секунд при 96 градусах Цельсия, пять секунд при 50 градусах Цельсия и четыре минуты при 60 градусах Цельсия.

После того, как реакция большого кристалла будет завершена, очистите реакцию с помощью большой очищающей пластины. После получения последовательностей проанализируйте их с помощью онлайн-анализатора Big или инструмента B-I-S-M-A, чтобы получить картину метилирования исследуемого участка ДНК, чтобы получить представление о влиянии стресса в раннем возрасте или ELS на экспрессию VP и статус метилирования. Черные палочки C 57 и мышей обрабатывали в соответствии с описанным протоколом, паравентрикулярное ядро и супраоптическое ядро пробивали для выделения ДНК, а R-N-A-D-N-A обрабатывали бисульфитом, амплифицировали праймерами, специфичными для энхансера VP, а продукты ПЦР клонировали и секвенировали не менее 20 рекомбинантных клонов от каждой мыши.

ПЦР были проанализированы для определения частот метилирования ЦПГ, содержащихся в ампликоне ПЦР в тканях из P-V-N-E-L-S, что индуцировало значительное гипометилирование в четырех местах на энхансере A VP, что свидетельствует об эпигенетической маркировке этой регуляторной области в раннем жизненном опыте. В отличие от метилирования ПВН энхансера A VP на ELS в SON, что иллюстрирует тканевую специфичность эпигенетического эффекта у контрольных животных, статус метилирования ДНК в CPG 10 отрицательно коррелировал с экспрессией гена VP, что указывает на роль метилирования ДНК в тонкой настройке экспрессии гена VP. После этой процедуры другие методы, такие как UPCR, могут быть легко применены к изолированной РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как изменения экспрессии генов в анализируемой ткани.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изучать изменения метилирования ДНК в ответ на факторы окружающей среды или испытываемые зависимые стимулы.