Дизайн, обработка поверхности, сотовая Покрытие и культивированию модульных нейронных сетей, состоящих из Функционально взаимосвязанных схем

Эта рукопись описывает протокол расти в пробирке модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функционально взаимосвязанных нейронов схем. Полимерный маска используется для шаблона белка слой, чтобы способствовать клеточной адгезии по сравнению с культивирования подложки. Плиты нейроны растут на покрытых областях, устанавливающих спонтанные связи и проявляющих электрофизиологические деятельности.

Общая цель этой процедуры заключается в выращивании in vitro модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функциональных, взаимосвязанных нейронных цепей. Это достигается путем предварительной подготовки трафаретов PDMS для моделирования белкового слоя, способствующего клеточной адгезии к культивируемому субстрату. Вторым этапом является очистка субстратов для культивирования.

В частности, поверхности чашек Петри, покровных пластин и многоэлектродных матриц. Затем трафареты PDMS наносятся на культурируемую основу и создаются желаемые узоры слоев адгезивного белка. Заключительным этапом является покрытие нейрональных глиальных клеток.

В конечном счете, записи с помощью многоэлектродной матрицы и визуализация кальция используются для демонстрации динамики достигнутых модульных нейронных сетей. Этот метод может помочь ответить на ключевые открытые вопросы в области нейробиологии, такие как исследование динамики коммуникации между нейронными сборками, и будет противодействовать экспериментальным условиям. Полиметилсоан или PDMS получают путем предварительного смешивания одной части отвердителя с 10 частями базового агента.

После пяти минут перемешивания переместите смесь в вакуумную камеру на 15 минут. Через 15 минут проверьте наличие пузырьков и верните раствор в камеру еще на 15 минут. Далее приготовьте на спин-кодере.

Откройте газовые ручки для газообразного азота. Наденьте на спиннер и закрепите ее на месте с помощью пылесоса. Затем насыпьте на пластину тонкий слой PDMS.

Вращайте пластину с помощью PDMS в течение минуты со скоростью 1000 об/мин, чтобы на пластине образовалось покрытие PDMS толщиной 100 микрон. Затем переложите на горячую плиту при температуре 100 градусов Цельсия. Дайте ему там запечься в течение 30 минут.

После того как PDMS затвердеет, с помощью пипетки обведите границы трафаретов большим количеством PDMS. Затем выпекайте добавленную PDMS на. Как и раньше, когда границы PDMS затвердеют, разрежьте трафарет по краям и снимите силиконовый трафарет с пластины, чтобы начать RINs.

Квадратная стеклянная крышка диаметром 23 миллиметра скользит дистиллированной водой, затем 70% этанола, затем ацетона, затем изопропанола и, наконец, дистиллированной воды. Снова просушите квадраты под струей газообразного азота. Далее аккуратно прижмите по одному шаблону трафарета PDMS к каждому покровному листу.

Поместите покровные листы с трафаретами в вакуумную камеру на 15 минут. После уборки пылесосом капните миллилитр PDL на трафареты и верните сборки в вакуумную камеру на 20 минут. Повторите 20-минутный цикл вакуума один раз, а затем дайте PDL высохнуть в течение ночи на следующий день.

Приготовьте чашки Петри, которые будут поддерживать сетевые ячейки. Первый. Накройте посуду на 3,5 сантиметра миллилитром PDL на два часа. При комнатной температуре позже удалите PDL из чашки путем аспирации.

Затем вымойте посуду дистиллированной водой и оставьте ее сушиться. После того, как блюдо высохнет, добавьте на блюдо небольшой объем силиконовой смазки в соответствии с четырьмя углами накладки крышки. Положите крышки на блюдо PDMS вверх и осторожно прижмите их, чтобы убедиться, что они прикреплены.

Теперь аккуратно выщипните A-P-D-M-S из защитных стекол, оставляя рисунок PDL. Наконец, простерилизуйте посуду, подвергая ее воздействию ультрафиолета в течение семи минут. Сначала очистите многоэлектродную решетку, промыв ее под водопроводной водой, а затем обработайте ультразвуком в концентрированном ферментативном моющем средстве.

Повторите эти действия три раза. Затем обработайте МЭА ультразвуком в чистой дистиллированной воде три раза, после чего под колпаком. Перед этим промойте MEA дистиллированной водой.

Стерилизуем его ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Затем сначала подготовьте поддерживающую сеть. Налейте PDMS в 12 или 24 луночную пластину.

Как только PDMS затвердеет, удалите его иглой. Теперь вырезаем отверстия в центре дисков, чтобы сделать кольца, которые работают как опора формы. Теперь поместите опору для формы в центр MEA и накройте внешнюю открытую поверхность MEA.

Дайте ему отстояться в течение двух часов в комнате. Затем отсадите PDL, промойте внешнюю открытую поверхность MEA дистиллированной водой и снимите опору формы, чтобы дать MEA высохнуть. Теперь приложите трафарет к подготовленному микроманипулятору под перевернутым микроскопом.

Осмотрите и выровняйте структурированную структуру в соответствии с электродами MEA. Затем с помощью микроманипулятора опустите трафарет на поверхность MEA. После прикрепления поднимите микрометровый манипулятор и, при необходимости, с помощью пинцета надавите на него, чтобы предотвратить отсоединение PDMS.

Теперь перенесите MEA в вакуумную камеру на 15 минут. Затем нанесите на трафарет каплю в один миллилитр PDL и вернитесь в вакуумную камеру на два цикла по 20 минут. Дайте PDL высохнуть в течение ночи на следующий день.

Удалите трафареты P DM S с лугов с помощью пинцета. Наконец, УФ-стерилизуйте ямы в течение семи минут. Затем они готовы к клеткам для подготовки культуральных клеток и приготовления суспензий, как в текстовом протоколе.

После того, как Resus подвешивает необходимое количество ячеек, поместите их в центр узорчатой области на MEA или покровном листе. В MEA следует загрузить объем 100 микролитров и крышку. Вмещает 1000 микролитров.

Инкубируйте пластинчатые клетки в течение 40 минут, затем добавляйте плоскую среду для поддержания клеток каждые четыре дня. Добавьте обратно свежую добавку питательной среды. После шестого или седьмого дня нейронные связи между модулями должны начать формироваться в этот момент.

Разведите питательную среду антимитотическим средством для предотвращения глиального разрастания. После четырех дней in vitro можно наблюдать, что нейроны, прикрепленные в PD DL, кодируют пятна площадью 600 микрон квадратного сечения через 14 дней. В культуре нейроны спонтанно устанавливают связи внутри модулей и между модулями, образуя активные функциональные сети.

Нейронные цепи размером 300 микрон квадрата наблюдались при наличии размера элемента PDMS при сохранении той же концентрации покрытия. Визуализация кальция проводилась с использованием объектива Forex для широкого определения активности в культивируемых сетях. Между зеленым и розовым модулями видно большее количество соединений, в то время как синий и красный модули менее связаны с другими модулями.

График начала кальциевых событий показан для фильма, полученного с частотой 30 герц и изображением размером 1 миллион пикселей. Зеленый и розовый модули были высоко синхронизированы, в то время как синий и красный модули были менее синхронизированы. Так, корковая модульная сеть, состоящая из трех различных цепей, была зарегистрирована через 21 день in vitro.

С помощью MEA было обнаружено, что нейронные цепи, расположенные на расстоянии около 600 микрон друг от друга, связаны между собой. Реконструирована их электрофизиологическая активность. Используя точный алгоритм обнаружения временных пиков, был построен график списка из пяти минут этих данных с цветовой кодировкой кластерных данных.

Это позволяет сравнивать активность всей сети и отдельного кластера, а также дает представление о внутрикластерной синхронности. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить трафареты PDM и использовать их для моделирования адгезии клеток нейроглии, что приводит к созданию функциональной модальной сети.