Дизайн, обработка поверхности, сотовая Покрытие и культивированию модульных нейронных сетей, состоящих из Функционально взаимосвязанных схем
15 апреля 2015 г.
Эта рукопись описывает протокол расти в пробирке модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функционально взаимосвязанных нейронов схем. Полимерный маска используется для шаблона белка слой, чтобы способствовать клеточной адгезии по сравнению с культивирования подложки. Плиты нейроны растут на покрытых областях, устанавливающих спонтанные связи и проявляющих электрофизиологические деятельности.
Общая цель этой процедуры заключается в выращивании in vitro модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функциональных, взаимосвязанных нейронных цепей. Это достигается путем предварительной подготовки трафаретов PDMS для моделирования белкового слоя, способствующего клеточной адгезии к культивируемому субстрату. Вторым этапом является очистка субстратов для культивирования.
В частности, поверхности чашек Петри, покровных пластин и многоэлектродных матриц. Затем трафареты PDMS наносятся на культурируемую основу и создаются желаемые узоры слоев адгезивного белка. Заключительным этапом является покрытие нейрональных глиальных клеток.
В конечном счете, записи с помощью многоэлектродной матрицы и визуализация кальция используются для демонстрации динамики достигнутых модульных нейронных сетей. Этот метод может помочь ответить на ключевые открытые вопросы в области нейробиологии, такие как исследование динамики коммуникации между нейронными сборками, и будет противодействовать экспериментальным условиям. Полиметилсоан или PDMS получают путем предварительного смешивания одной части отвердителя с 10 частями базового агента.
После пяти минут перемешивания переместите смесь в вакуумную камеру на 15 минут. Через 15 минут проверьте наличие пузырьков и верните раствор в камеру еще на 15 минут. Далее приготовьте на спин-кодере.
Откройте газовые ручки для газообразного азота. Наденьте на спиннер и закрепите ее на месте с помощью пылесоса. Затем насыпьте на пластину тонкий слой PDMS.
Вращайте пластину с помощью PDMS в течение минуты со скоростью 1000 об/мин, чтобы на пластине образовалось покрытие PDMS толщиной 100 микрон. Затем переложите на горячую плиту при температуре 100 градусов Цельсия. Дайте ему там запечься в течение 30 минут.
После того как PDMS затвердеет, с помощью пипетки обведите границы трафаретов большим количеством PDMS. Затем выпекайте добавленную PDMS на. Как и раньше, когда границы PDMS затвердеют, разрежьте трафарет по краям и снимите силиконовый трафарет с пластины, чтобы начать RINs.
Квадратная стеклянная крышка диаметром 23 миллиметра скользит дистиллированной водой, затем 70% этанола, затем ацетона, затем изопропанола и, наконец, дистиллированной воды. Снова просушите квадраты под струей газообразного азота. Далее аккуратно прижмите по одному шаблону трафарета PDMS к каждому покровному листу.
Поместите покровные листы с трафаретами в вакуумную камеру на 15 минут. После уборки пылесосом капните миллилитр PDL на трафареты и верните сборки в вакуумную камеру на 20 минут. Повторите 20-минутный цикл вакуума один раз, а затем дайте PDL высохнуть в течение ночи на следующий день.
Приготовьте чашки Петри, которые будут поддерживать сетевые ячейки. Первый. Накройте посуду на 3,5 сантиметра миллилитром PDL на два часа. При комнатной температуре позже удалите PDL из чашки путем аспирации.
Затем вымойте посуду дистиллированной водой и оставьте ее сушиться. После того, как блюдо высохнет, добавьте на блюдо небольшой объем силиконовой смазки в соответствии с четырьмя углами накладки крышки. Положите крышки на блюдо PDMS вверх и осторожно прижмите их, чтобы убедиться, что они прикреплены.
Теперь аккуратно выщипните A-P-D-M-S из защитных стекол, оставляя рисунок PDL. Наконец, простерилизуйте посуду, подвергая ее воздействию ультрафиолета в течение семи минут. Сначала очистите многоэлектродную решетку, промыв ее под водопроводной водой, а затем обработайте ультразвуком в концентрированном ферментативном моющем средстве.
Повторите эти действия три раза. Затем обработайте МЭА ультразвуком в чистой дистиллированной воде три раза, после чего под колпаком. Перед этим промойте MEA дистиллированной водой.
Стерилизуем его ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Затем сначала подготовьте поддерживающую сеть. Налейте PDMS в 12 или 24 луночную пластину.
Как только PDMS затвердеет, удалите его иглой. Теперь вырезаем отверстия в центре дисков, чтобы сделать кольца, которые работают как опора формы. Теперь поместите опору для формы в центр MEA и накройте внешнюю открытую поверхность MEA.
Дайте ему отстояться в течение двух часов в комнате. Затем отсадите PDL, промойте внешнюю открытую поверхность MEA дистиллированной водой и снимите опору формы, чтобы дать MEA высохнуть. Теперь приложите трафарет к подготовленному микроманипулятору под перевернутым микроскопом.
Осмотрите и выровняйте структурированную структуру в соответствии с электродами MEA. Затем с помощью микроманипулятора опустите трафарет на поверхность MEA. После прикрепления поднимите микрометровый манипулятор и, при необходимости, с помощью пинцета надавите на него, чтобы предотвратить отсоединение PDMS.
Теперь перенесите MEA в вакуумную камеру на 15 минут. Затем нанесите на трафарет каплю в один миллилитр PDL и вернитесь в вакуумную камеру на два цикла по 20 минут. Дайте PDL высохнуть в течение ночи на следующий день.
Удалите трафареты P DM S с лугов с помощью пинцета. Наконец, УФ-стерилизуйте ямы в течение семи минут. Затем они готовы к клеткам для подготовки культуральных клеток и приготовления суспензий, как в текстовом протоколе.
После того, как Resus подвешивает необходимое количество ячеек, поместите их в центр узорчатой области на MEA или покровном листе. В MEA следует загрузить объем 100 микролитров и крышку. Вмещает 1000 микролитров.
Инкубируйте пластинчатые клетки в течение 40 минут, затем добавляйте плоскую среду для поддержания клеток каждые четыре дня. Добавьте обратно свежую добавку питательной среды. После шестого или седьмого дня нейронные связи между модулями должны начать формироваться в этот момент.
Разведите питательную среду антимитотическим средством для предотвращения глиального разрастания. После четырех дней in vitro можно наблюдать, что нейроны, прикрепленные в PD DL, кодируют пятна площадью 600 микрон квадратного сечения через 14 дней. В культуре нейроны спонтанно устанавливают связи внутри модулей и между модулями, образуя активные функциональные сети.
Нейронные цепи размером 300 микрон квадрата наблюдались при наличии размера элемента PDMS при сохранении той же концентрации покрытия. Визуализация кальция проводилась с использованием объектива Forex для широкого определения активности в культивируемых сетях. Между зеленым и розовым модулями видно большее количество соединений, в то время как синий и красный модули менее связаны с другими модулями.
График начала кальциевых событий показан для фильма, полученного с частотой 30 герц и изображением размером 1 миллион пикселей. Зеленый и розовый модули были высоко синхронизированы, в то время как синий и красный модули были менее синхронизированы. Так, корковая модульная сеть, состоящая из трех различных цепей, была зарегистрирована через 21 день in vitro.
С помощью MEA было обнаружено, что нейронные цепи, расположенные на расстоянии около 600 микрон друг от друга, связаны между собой. Реконструирована их электрофизиологическая активность. Используя точный алгоритм обнаружения временных пиков, был построен график списка из пяти минут этих данных с цветовой кодировкой кластерных данных.
Это позволяет сравнивать активность всей сети и отдельного кластера, а также дает представление о внутрикластерной синхронности. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить трафареты PDM и использовать их для моделирования адгезии клеток нейроглии, что приводит к созданию функциональной модальной сети.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается протокол выращивания in vitro модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функционально взаимосвязанных нейронных цепей. Это достигается путем подготовки трафаретов из PDMS для формирования белкового слоя, который способствует адгезии клеток на подложке для культивирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Электрофизиология
Введение
- Нейронные сети in vitro имеют важное значение для изучения нейронных связей.
- Пространственное ограничение нейронных цепей может усилить функциональную взаимосвязь.
- Клеточная адгезия имеет решающее значение для успешного роста нейронов.
- Трафареты из ПДМС обычно используются для создания паттернов в культурах клеток.
Цель исследования
- Разработать метод создания модульных нейронных сетей in vitro.
- Исследовать электрофизиологические свойства этих сетей.
- Установить спонтанные связи между высеянными нейронами.
Используемые методы
- Приготовление трафаретов из ПДМС для формирования белковых паттернов.
- Очистка подложек для культивирования, таких как чашки Петри и покровные стекла.
- Наложение трафаретов из ПДМС на подложку для создания адгезивных паттернов.
- Посев нейрональных глиальных клеток на подготовленную подложку с паттернами.
Основные результаты
- Успешное создание пространственно ограниченных нейронных цепей.
- Демонстрация спонтанных связей между нейронами.
- Наблюдение электрофизиологической активности в культивируемых сетях.
- Валидация протокола для будущих исследований связности нейронов.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно создавать модульные нейронные сети in vitro.
- Пространственное ограничение усиливает функциональную взаимосвязь.
- Этот метод может быть использован для дальнейших электрофизиологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная методика создания модульных нейронных сетей in vitro обеспечивает точный пространственный контроль над нейронными ансамблями, что способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней в процессе разработки нейробиологических препаратов. Создавая функционально взаимосвязанные цепи с количественно оцениваемыми данными электрофизиологического анализа и кальциевого имиджинга, этот подход обеспечивает прогностическую достоверность в анализах нейронной связности. Он решает ключевую задачу этапа поиска новых соединений: моделирование динамики мозговых цепей для оценки влияния препаратов на синхронность и взаимодействие внутри сети.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем модуляции расстояния между компартментами для регулирования синхронизации между модулями.
- Практическая ценность: предоставляет релевантную для заболевания систему для оценки взаимодействия с мишенью посредством спонтанного формирования нейронных цепей и установления функциональных сетей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные измерения зависимых переменных с помощью записей многоэлектродными матрицами и кальциевого имиджинга для оценки динамики активности сети.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет воспроизводимого создания шаблонов из PDMS и осаждения белкового слоя для обеспечения стабильной адгезии клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает согласование трансляционных биомаркеров путем корреляции плотности связей с возникновением синхронизации, что позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков.
- Практическая ценность: Облегчает преемственность доклинических моделей, позволяя наблюдать формирование нейронных связей через 6–7 дней in vitro и их стабилизацию к 14-му дню.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в рабочие процессы ранних этапов поиска новых лекарственных средств, позволяя проверять гипотезы о динамике нейронных коммуникаций, при этом полученные результаты напрямую способствуют идентификации перспективных соединений-лидеров посредством профилирования сетевой активности.
- Фундаментальная биология: способствует уточнению путей передачи сигналов, позволяя контролируемо исследовать, как плотность соединений регулирует межмодульную синхронизацию в модульных сетях.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных протоколов обработки поверхности и посева клеток, которые гарантируют воспроизводимое прикрепление нейронов к областям, структурированным с помощью PDL.
- Аналитика: обеспечивает электрофизиологическую регистрацию спайков и измерение начала кальциевых событий, что позволяет количественно сравнивать внутрикластерную и межкластерную синхронность при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: способствует доклинической валидации, демонстрируя спонтанное формирование функциональных сетей, которые отражают принципы взаимодействия цепей in vivo.
- Повторное использование в организации: создает возможность многократного формирования паттернов нейронных сетей на различных подложках (покровные стекла, MEA) для поддержки повторяющихся кампаний по скринингу и исследований по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации нейронных мишеней, предоставляя контролируемую систему для изучения влияния структурной топологии на функциональную связность.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет использования вакуумного нанесения PDL и этапов УФ-стерилизации, которые обеспечивают единообразную подготовку поверхности во всех экспериментах.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), позволяя проводить тесты зависимости «доза-ответ» соединений по параметру синхронности сети, что снижает биологические риски на поздних стадиях разработки препаратов для ЦНС.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем количественной оценки порогов синхронизации, зависящих от связей, что позволяет снизить механистические риски при работе с нейронными мишенями.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в изготовлении микрофлюидных трафаретов, культивировании нейронов, а также в методах электрофизиологической и оптической регистрации.
- Необходимо наличие оборудования для центрифужного нанесения покрытий (спин-коатера), вакуумных камер, УФ-стерилизаторов, многоэлектродных матриц (MEA) и систем кальциевого имиджинга.
- Требуется межкомандная стандартизация дизайна трафаретов, протоколов покрытия белками и плотности посева для обеспечения воспроизводимости результатов между лабораториями.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных подтипов нейронов или соотношений в кокультуре с глией для поддержания стабильности сети и предотвращения избыточного разрастания клеток.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость точного совмещения трафарета с электродами MEA и зависимость размеров цепей от размера структур PDMS (например, квадратных модулей 300 micron).
