Взаимодействие 3D конструктивных нейронов культур Микро-матриц электродов: Инновационный In Vitro Экспериментальная модель

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы представить новую модель трехмерных нейронных сетей in vitro, соединенных с микроэлектродными массивами. Это достигается путем предварительного кондиционирования, когда центральная часть МЭА со смешанным раствором поли-делизина и ламинина затем покрывает микрогранулы белками адгезии, ламинином и полилизином. Второй шаг заключается в распределении суспензии обработанных микрогранул на многолуночную пластину, где они будут самособираться и образовывать равномерный слой.

Третий шаг процедуры заключается в размещении клеток на активной области MEA с плотностью 2000 клеток на квадратный миллиметр для создания двухмерных нейронных сетей. Через шесть-восемь часов после нанесения покрытия суспензия переносится из многолуночных планшетов в MEA, и микрогранулам дают возможность самособраться в гексагональную компактную структуру. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для визуализации 3D-сетей, которые сравниваются с обычными двумерными нейронными сетями, выращенными на MEA.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как объемные клеточные культуры in vitro, заключается в том, что в размерной модели BDI соматы и конусы роста сплющиваются, Андон и восход не могут распространяться во всех направлениях. Кроме того, взрывная активность доминирует в электрофизиологической динамике размерных сетей BDI, в то время как в трехмерной сети также сосуществует случайная активность спекуляции. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы прочитали исследовательскую статью Софи Потто, опубликованную в журнале Nature Method в 2008 году, в которой она использовала микробиты в качестве каркаса для построения трехмерных сетей.

Затем мы адаптировали этот метод для создания первых трехмерных записей in vitro. Чтобы приготовить эластомер PDMS, смешайте отвердитель и полимер в объемном соотношении один к девяти в чашке Петри. Затем встряхните смесь и поместите ее в вакуумную камеру на 10 минут для устранения пузырьков воздуха.

Чтобы построить ограничение PDMS, вставьте материал PDMS в более старую форму, после этого поставьте его в духовку на 30 минут при температуре 120 градусов Цельсия. Ограничение PDMS должно иметь форму цилиндра с внешним и внутренним диаметром 22,0 и 3,0 миллиметра соответственно, и высотой 650 микрометров за сутки до нанесения покрытия. Соедините маску с активной зоной MEA под стереомикроскопом, затем стерилизуйте маску PDMS в духовке при температуре 120 градусов Цельсия.

Затем простерилизуйте стеклянные микрошарики в коническом флаконе с содержанием этанола 70% в течение двух часов, вращая каждые 30 минут, чтобы обнажить все микрогранулы. Достаньте раствор этанола из флакона и дважды промойте микрошарики стерилизованной водой. Затем кондиционируют центральную часть участка МЭА, ограниченную маской PDMS, с 24 микролитрами смешанного раствора полилизина и ламинина в концентрации 0,05 мкг на миллилитр.

Покройте микрогранулы адгезионными белками, ламинатом и полилизином в дозе 0,05 мкг на миллилитр. Впоследствии поместите их в инкубатор на ночь при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы получить стабильную и долговечную нейронную сеть. После этого распределите суспензию обработанных микрогранул на многолуночный планшет с мембранной вставкой, где они будут самособираться и образовывать равномерный слой.

Затем заполните каждую лунку мембраны 0,5 миллилитрами среды. Поместите его в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока нейроны не будут готовы к осаждению на этом этапе. После принесения в жертву беременной самки крысы Е 18 получите эмбрионы крысы, а затем удалите бегемота из каждого эмбриона крысы.

Положите их в ледяные хлопотки. Сбалансируйте солевой раствор без кальция и магния. Затем диссоциируйте ткань в 0,125% раствора Хэнкса, содержащего 0,05% ДНК, в течение 18-20 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки peor. Остановите ферментативное переваривание, добавив среду с 10% FBS в течение пяти минут. Затем удалите среду с помощью FBS и промойте один раз питательной средой, ее добавкой 1% L-глутамина и гентамицина в дозе 10 мкг на миллилитр.

Впоследствии удалите среду. Снова наполните его 500 микролитрами роста. Терпимая. Его добавка 1% L-глутамина и гентамицина в концентрации 10 микрограмм на миллилитр.

Диссоциируйте тканевую гранулу механическим способом с помощью узкой ПЭ-пипетки до появления молочной суспензии клеток. После этого разведите небольшой объем клеточной суспензии с питательной средой до получения конечного объема в 2,0 миллилитров. Подсчитайте полученную клеточную концентрацию с помощью камеры гемоцитометра.

Затем разбавьте эту концентрацию в соотношении один к пяти, чтобы получить желаемую концентрацию клеток от 600 до 700 клеток на микролитр. Поместите клетки с плотностью 2000 клеток на квадратный миллиметр на активную область MEA, определенную ограничением PDMS, чтобы создать двумерную нейронную сеть. Затем поместите устройство MEA в инкубатор с 5% увлажненной атмосферой углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы завершить предварительный этап создания 3D-культуры, распределите 160 микролитров суспензии с концентрацией клеток от 600 до 700 клеток на микролитр на поверхность монослоя микрогранул, расположенного внутри многолуночных планшетов. Затем поместите многолуночные планшеты в инкубатор с 5% увлажненной атмосферой углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия, через шесть-восемь часов после нанесения покрытия перенесите от 30 до 40 микролитров суспензии с микрогранулами и нейронами в область MEA, ограниченную ограничением PDMS. После каждого переноса подождите около полуминуты, чтобы микрошарики самособрались в шестиугольную структуру.

После того, как все слои нанесены и самопроизвольно собраны в 300 микролитрах среды на верхней части области, ограниченной ограничением PDMS. Поместите 3D-структуру, соединенную с MEA, в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 48 часов. После этого добавьте один миллилитр питательной среды с ее добавкой через три недели in vitro, 3D-структура стабильна также без показанного ограничения PDMS.

Ниже приведено DIC-изображение одного слоя шариков, соединенных с поверхностью MEA. Положение черных точек представляет собой пространственное расположение электродов. Иммунофлуоресцентное окрашивание для второй карты, которое отражается красным сигналом, отображает распределение дендритной арборизации и ADA нейронов вокруг микрогранул, непосредственно связанных с плоскостью электродов MEA.

На этом изображении показана максимальная проекция последовательности Зака 3D-культуры, демонстрирующей высоковзаимосвязанную сеть, где нейроны помечены для нового N, экспрессируемого в зрелых постмитотических нейронах. А для ГАМК, вот репрезентативная электрофизиологическая запись сетей гиппокампа в 3D-конфигурации. А вот репрезентативная электрофизиологическая запись сетей гиппокампа в 2D-конфигурации.

После освоения этой процедуры ее можно проделать за семь часов. Однако стоит отметить, что поскольку процедура состоит из нескольких этапов, которые были выполнены в течение разных дней, оценка времени для реализации всей процедуры является лишь ориентировкой. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что сначала нужно нанести 2D-слой нейрона диуретика на электрод меа, а затем очень осторожно перенести суспензию микробитов и нейронов с многолуночной пластины на меа, чтобы реализовать трехмерную структуру после ее развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области вычислительной нейробиологии, чтобы изучить, как сетевая связность может формировать эмерджентную сетевую динамику. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как построить in vitro трехмерную нейронную сеть, соединенную с микроэлектродными массивами.