Анатомически вдохновленные трехмерные микротамовые инженерные нейронные сети для восстановления, модуляции и моделирования нервной системы

Этот протокол описывает создание микротканевых нейронных сетей или микро-ТЭНН, которые представляют собой миниатюрные трехмерные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных путей, охватывающих дискретные нейронные популяции в просвете трубчатого гидрогеля. Микро-ТЭНы воспроизводят общую анатомию коннектома мозга на системном уровне, а именно функционально сходные группы нейронов, соединенных длинными аксональными путями. Поскольку микро-ТЭНН предварительно выращены для имитации цитоархитектуры мозговых путей, они могут быть применены для целенаправленной реконструкции нейронных цепей, утраченных из-за травмы или нейродегенеративного заболевания, а также в качестве биоточных моделей для нейробиологических исследований.

Одним из самых сложных аспектов этого протокола является работа с форм-фактором микронного масштаба, который в конечном итоге необходим для обеспечения минимально инвазивной доставки в мозг. Начните с того, что вручную разломайте стеклянные капиллярные трубки на фрагменты размером от 2 до 2,5 сантиметра и вставьте одну акупунктурную иглу в каждый фрагмент. Переложите один миллилитр трехпроцентной агарозы в DPBS на поверхность пустой чашки Петри.

Удерживая капиллярную трубку во введенной игле, поместите один конец трубки в контакт с жидкой агарозной лужей, чтобы заполнить ее капиллярным действием. Когда жидкость перестанет подниматься, извлеките капиллярную трубку из бассейна, и поставьте ее горизонтально на поверхность чашки Петри. Затем поместите большой и указательный пальцы по обе стороны трубки и крепко возьмите.

Другой рукой быстро вытащите иглу, в то время как большой и указательный пальцы предотвращают выскальзывание микроколонки из трубки. Затем вставьте иглу 30-го калибра в капиллярную трубку, чтобы медленно вытолкнуть микроколонку в чашку, содержащую DPBS. Осторожно перенесите одну микроколонку из DPBS в пустую чашку с помощью тонких щипцов.

Добавьте 10 микролитров DPBS в верхнюю часть микроколонки с помощью микропипетки для предотвращения высыхания. Работая под стереомикроскопом, совершайте подножку микроколонки микроскальпелем, чтобы укоротить ее до нужной длины. Затем с помощью тонких щипцов перенесите обрезанную микроколонку в другую чашку Петри, содержащую DBPS.

Простерилизовать микроколонны в чашках Петри, содержащих DPBS, под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. С помощью сверла проколите 16 отверстий в виде 4-сантиметрового массива 4 на 4 с интервалом 1 сантиметр в крышку 10-сантиметровой чашки Петри. Внутри вытяжного шкафа для химических веществ используйте нижнюю часть чашки Петри, чтобы взвесить 27 граммов PDMS и три грамма отвердителя.

Перемешайте микрошпателем, чтобы средство распределилось равномерно. Затем накройте отвердитель PDMS проколотой крышкой. Подсоедините один конец шланга к вакуумному отверстию вытяжного шкафа, а другой конец вставьте в шток воронки подходящего размера.

Поместите в шланг 1-миллилитровую колбу для пипетки на наконечнике объемом 1 миллилитр и потяните шланг вверх до тех пор, пока лампа не запечатает шланг в стебле воронки. Далее поместите воронку на проколотую крышку посуды и закрепите шланг имеющейся прочной опорой. Откройте вакуумный клапан на пять минут для всасывания и выведите пузырьки воздуха на поверхность.

Через пять минут закройте клапан, снимите воронку и несколько раз ударьте чашкой Петри о поверхность вытяжного шкафа, чтобы лопнуть оставшиеся пузырьки воздуха. Поместите пирамидальную форму, напечатанную на 3D-принтере, в каждую из лунок в 12-луночную культуральную пластину пирамидами вверх. Затем залейте отвердитель PDMS поверх форм, пока каждая лунка пластины не будет заполнена.

Перенесите накрытую тарелку в духовку на один час при температуре 60 градусов Цельсия для высыхания. После стерилизации массивов PDMS методом автоклавирования и работы в шкафу биобезопасности вставьте по одному массиву микролунок в каждую лунку стерильного 12-луночного планшета. Чтобы сформировать нейронные агрегаты, с помощью микропипетки добавьте 12 микролитров клеточной суспензии в каждую микролунку матрицы PDMS.

Центрифугируйте планшет при 200-кратном g в течение пяти минут, чтобы вызвать агрегацию ячеек на дне микролунок. Затем осторожно добавьте примерно два миллилитра питательной среды в верхнюю часть каждого массива PDMS, чтобы покрыть все засеянные микролунки. Инкубируйте планшет от 12 до 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Чтобы начать изготовление ядра CEM, смешайте коллаген 1-го типа, ламинин и питательную среду в микроцентрифужной пробирке и отрегулируйте pH до 7,2–7,4. Затем поместите пробирку с CEM на лед. Используйте стерильные щипцы для переноса микроколонок в пустые 35 или 60-миллиметровые чашки Петри.

Затем, работая под стереомикроскопом, с помощью наконечника объемом 10 микролитров, прикрепленного к наконечнику объемом 1000 микролитров, следует извлечь из просвета остаточные DPBS и пузырьки воздуха. Быстро наберите четыре-пять микролитров CEM в микропипетке, затем поместите кончик микропипетки на один конец микроколонки и выпустите достаточное количество CEM, чтобы заполнить просвет. Чтобы предотвратить обезвоживание, добавьте два микролитра CEM вокруг каждой микроколонки.

Инкубируйте микроколонки гидрогеля CEM в чашках Петри при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 15 минут. Приступайте к посеву клеток сразу после инкубации. Перенесите примерно от 10 до 20 микролитров питательной среды в две свободные области в чашках Петри, где находятся микроколонны.

Используйте микропипетку, чтобы собрать нейронные агрегаты по отдельности и перенести их в чашку Петри, содержащую конструкции. Переместите агрегаты с помощью щипцов в один из небольших бассейнов питательной среды, чтобы сохранить здоровье клеток. При наблюдении под стереомикроскопом используйте щипцы для введения агрегата на одном конце микроколонок для однонаправленных микро-ТЭНов или на каждом конце для двунаправленной архитектуры.

Затем переместите засеянный микростолбец в другой небольшой бассейн питательной среды, чтобы избежать обезвоживания и сохранить здоровье агрегата. Когда все микроколонны будут загружены, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 45 минут, чтобы заполнители могли прилипнуть к CEM. После инкубации с помощью стереомикроскопа убедитесь, что агрегаты остаются на концах микроколонок.

Наконец, осторожно залейте чашки Петри, содержащие микро-ТЭННы, питательной средой с помощью пипетки. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе для длительного выращивания. Эти фазово-контрастные изображения показывают однонаправленные микро-ТЕННЫ длиной 2 миллилитра до восьми дней in vitro.

На этих изображениях обратите внимание на нейронные агрегаты на концах микроколонки, в то время как выровненные аксональные тракты проецируются через просвет. Как видно на рисунке, аксональные тракты простираются почти по всей длине микроколонки на пять дней in vitro. Для 5-миллиметровых двунаправленных микро-TENN аксональные тракты заполняют длину микроколонки в течение 5 дней in vitro, и эта архитектура сохраняется, по крайней мере, до 10 дней in vitro.

Следующие два изображения могут помочь устранить неполадки, связанные с процедурой. На этом изображении показана полностью обезвоженная высушенная гидрогелевая микроколонна в результате полного удаления и/или испарения DPBS, CEM или питательной среды во время изготовления. На этом изображении показан микростолбик с просветом, выстилающим наружную стенку из-за отсутствия концентрического выравнивания акупунктурной иглы с капиллярной трубкой.

Наконец, на этом конфокальном изображении показан двунаправленный микро-TENN через 28 дней in vitro, окрашенный для ядра клеток синим цветом Хёхста, и аксонами, помеченными красным цветом tudge one, и пресинаптическими бутонами, помеченными синапсином 1 зеленым цветом. Миграция клеток из агрегатов по аксональным трактам наблюдается в присутствии пресинаптических окончаний, как предполагается. Микро-ТЭНы представляют собой самодостаточные, анатомически вдохновленные конструкции, которые имитируют ключевые аспекты цитоархитектуры коннектома; таким образом, микро-ТЭНы могут обеспечить средства для замены утраченных нейронных путей после имплантации в мозг.

Важнейшими компонентами этого метода являются схема оболочки трубчатого биоматериала, которая позволяет осуществлять продольный рост аксонов, и агрегатный метод, обеспечивающий получение надлежащей цитоархитектоники клеточных тел, ограниченных концами аксональных трактов вдоль внутренней части. После овладения этими методами принципы этой методики могут быть применены для создания микро-ТЭНН с другими клеточными фенотипами и компонентами биоматериала, в соответствии с конкретным применением.