Анатомически вдохновленные трехмерные микротамовые инженерные нейронные сети для восстановления, модуляции и моделирования нервной системы

В данном протоколе описывается создание микротканеинженерных нейронных сетей (micro-TENNs), которые представляют собой миниатюрные трехмерные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных трактов, соединяющих отдельные популяции нейронов внутри просвета трубчатого гидрогеля. Micro-TENNs воспроизводят общую анатомию коннектома мозга на системном уровне, а именно функционально схожие группы нейронов, соединенные длинными аксональными трактами. Поскольку они предварительно выращены для имитации цитоархитектоники проводящих путей мозга, micro-TENNs могут применяться для направленной реконструкции нейронных цепей, утраченных в результате травм или нейродегенеративных заболеваний, а также в качестве биофидельных моделей для нейробиологических исследований.

Одним из наиболее сложных аспектов данного протокола является работа с объектами микронного масштаба, что в конечном итоге необходимо для обеспечения минимально инвазивного введения в мозг. Начните с того, что вручную разбейте стеклянные капиллярные трубки на фрагменты длиной от 2 до 2,5 см и вставьте в каждый фрагмент по одной акупунктурной игле. Перенесите 1 mL 3% агарозы в DPBS на поверхность пустой чашки Петри.

Удерживая капиллярную трубку в установленной игле, прикоснитесь одним концом трубки к поверхности жидкого агарозного геля, чтобы он заполнил ее за счет капиллярного эффекта. Когда жидкость перестанет подниматься, извлеките капиллярную трубку из геля и положите ее горизонтально на поверхность чашки Петри. Затем расположите большой и указательный пальцы по обе стороны от трубки и крепко сожмите ее.

Другой рукой быстро вытяните иглу, придерживая микроколонку большим и указательным пальцами, чтобы она не выскальзывала из трубки. Затем вставьте иглу 30-го калибра в капиллярную трубку, чтобы медленно вытолкнуть микроколонку в чашку с DPBS. С помощью тонкого пинцета осторожно перенесите одну микроколонку из DPBS в пустую чашку.

С помощью микропипетки добавьте 10 µL DPBS на верхнюю часть микроколонки, чтобы предотвратить ее высыхание. Работая под стереомикроскопом, обрежьте микроколонку микроскальпелем до нужной длины. Затем с помощью тонкого пинцета перенесите обрезанную микроколонку в другую чашку Петри с DPBS.

Стерилизуйте микроколонки в чашках Петри с DPBS под воздействием ультрафиолетового излучения в течение 30 минут. С помощью сверла проделайте 16 отверстий в крышке чашки Петри диаметром 10 см, расположив их массивом 4 на 4 сантиметра с интервалом в 1 см. В вытяжном шкафу используйте нижнюю часть чашки Петри, чтобы взвесить 27 г PDMS и 3 г отвердителя.

Перемешайте содержимое микрошпателем для равномерного распределения агента. Затем накройте отвердитель PDMS перфорированной крышкой. Подсоедините один конец шланга к вакуумному порту вытяжного шкафа, а другой конец вставьте в носик воронки подходящего размера.

Наденьте грушу для дозирования 1 мл на наконечник объемом 1 мл и вставьте его в шланг, потянув шланг вверх до тех пор, пока груша не обеспечит герметичное соединение шланга со стеблем воронки. Затем установите воронку на проколотую крышку чашки и закрепите шланг с помощью имеющейся надежной опоры. Откройте вакуумный клапан на пять минут, чтобы создать разрежение и поднять пузырьки воздуха на поверхность.

Через пять минут закройте клапан, снимите воронку и несколько раз постучите чашкой Петри о поверхность вытяжного шкафа, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха. Поместите в каждую лунку 12-луночного культурального планшета 3D-печатную форму с пирамидальными углублениями вершинами вверх. Затем залейте отвердитель PDMS сверху в формы до заполнения каждой лунки планшета.

Перенесите закрытый планшет в термостат на один час при 60 °C для высушивания. После стерилизации массивов PDMS путем автоклавирования и в условиях бокса биологической безопасности поместите по одному массиву микролунок в каждую лунку стерильного 12-луночного планшета. Для формирования нейрональных агрегатов с помощью микропипетки добавьте 12 µL клеточной суспензии в каждую микролунку массива PDMS.

Центрифугируйте планшет с ускорением 200 ×g в течение пяти минут, чтобы обеспечить агрегацию клеток на дне микролунок. Затем осторожно добавьте примерно два миллилитра культуральной среды на верхнюю часть каждого массива PDMS, чтобы покрыть все заполненные микролунки. Инкубируйте планшет от 12 до 24 часов при 37 °C в среде с 5% CO₂.

Для начала изготовления ядра CEM смешайте коллаген 1 типа, ламинин и культуральную среду в микроцентрифужной пробирке и доведите pH до 7,2–7,4. Затем поместите пробирку с CEM на лед. С помощью стерильного пинцета перенесите микроколонки в пустые чашки Петри диаметром 35 или 60 мм.

Затем, работая под стереомикроскопом, используйте наконечник объемом 10 µL, прикрепленный к наконечнику объемом 1000 µL, чтобы удалить остатки DPBS и пузырьки воздуха из просвета. Быстро наберите в микропипетку 4–5 µL CEM, затем поместите кончик микропипетки на один конец микроколонки и введите достаточное количество CEM для заполнения просвета. Чтобы предотвратить дегидратацию, добавьте по 2 µL CEM вокруг каждой микроколонки.

Инкубируйте гидрогелевые микроколонки CEM в чашках Петри при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 15 минут. Сразу после инкубации приступите к посеву клеток. Перенесите примерно 10–20 µL культуральной среды на две свободные области в чашках Петри, содержащих микроколонки.

Используйте микропипетку, чтобы собрать отдельные нейрональные агрегаты и перенести их в чашку Петри с конструктами. Переместите агрегаты пинцетом в одну из небольших капель культуральной среды для сохранения жизнеспособности клеток. Наблюдая под стереомикроскопом, с помощью пинцета поместите агрегат на один конец микроколонок для создания однонаправленных микро-TENN или на оба конца для создания двунаправленной архитектуры.

Затем перенесите засеянную микроколонку в другой небольшой объем культуральной среды, чтобы избежать дегидратации и сохранить жизнеспособность агрегатов. После заполнения всех микроколонок инкубируйте их при 37 °C в 5% carbon dioxide в течение 45 минут, чтобы агрегаты прикрепились к CEM. После инкубации с помощью стереомикроскопа убедитесь, что агрегаты остались на концах микроколонок.

Наконец, аккуратно залейте чашки Петри с микро-TENN культуральной средой с помощью пипетки. Поместите чашки в инкубатор при 37 °C в 5% CO2 для длительного культивирования. На этих изображениях, полученных с помощью фазового контраста, показаны однонаправленные микро-TENN длиной 2 мм в условиях in-vitro на срок до восьми дней.

На этих изображениях обратите внимание на нейрональные агрегаты на концах микроколонки, в то время как выровненные аксональные тракты проходят через просвет. Как видно здесь, к пятому дню in-vitro аксональные тракты extending почти на всю длину микроколонки. В случае двунаправленных микро-TENN длиной 5 мм аксональные тракты заполняют всю длину микроколонки к 5-му дню in-vitro, и такая архитектура сохраняется как минимум до 10-го дня in-vitro.

Следующие два изображения помогут в устранении проблем при выполнении процедуры. На этом изображении показана полностью дегидратированная высушенная микроколонка гидрогеля, возникшая в результате полного удаления и/или испарения DPBS, CEM или питательной среды в процессе изготовления. На этом изображении показана микроколонка, в которой просвет прилегает к внешней стенке из-за отсутствия концентрического выравнивания иглы для акупунктуры относительно капиллярной трубки.

Наконец, на этом конфокальном изображении представлена двунаправленная микро-TENN через 28 дней культивирования in-vitro; ядра клеток окрашены Hoechst в синий цвет, аксоны помечены tudge one красным, а пресинаптические бутоны — synapsin 1 зеленым. Наблюдается миграция клеток из агрегатов вдоль аксональных трактов в присутствии пресинаптических терминалей, как и предполагалось. Микро-TENN представляют собой автономные, анатомически обоснованные конструкции, которые имитируют ключевые аспекты цитоархитектоники коннектома; следовательно, микро-TENN могут стать средством восстановления утраченных нейронных путей после имплантации в мозг.

Ключевыми компонентами данного метода являются схема трубчатого покрытия биоматериалом, которая обеспечивает продольный рост аксонов, и метод агрегации, гарантирующий формирование правильной цитоархитектоники тел клеток, ограниченных концами аксональных трактов вдоль внутренней поверхности. После освоения этих методов принципы данной техники могут быть применены для создания микро-TENN с другими фенотипами клеток и компонентами биоматериалов в зависимости от конкретной области применения.