Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить первые последствия мутаций в факторах инициации трансляции без вмешательства вновь транскрибируемой мРНК или проблем с эффективностью трансфекции, часто возникающих при исследованиях эукариотических клеток. Это достигается путем предварительного синтеза мутантной мРНК дикого типа и контроля, или GFP, из соответствующих плазмид. Далее синтезированную РНК микроинъецируют в циты XUS Lavis на шестой стадии, а их созревание стимулируют прогестероном.

Затем созревание цитов оценивают с помощью визуализации пробоя зародышевых пузырьков, а некоторые компоненты каскада киназ MA, активация которых зависит от экспрессии белка мха, анализируют с помощью вестерн-блоттинга. Наконец, изучено мРНК-полиаденилирование мха и других мРНК, необходимых для восстановления миоза XPO-цитов. В конечном итоге происходит кинетическое созревание цита

Вестерн-блоттинг и полиаденилирование используются для того, чтобы показать потенциальное влияние экспрессии белка при мутации фактора инициации трансляции. Основное преимущество этой методики перед существующими нами методами или восстановленной клеточной системой, извлеченной в равной степени из ретикулоцитов зародыша или кролика, заключается в том, что эффекты мутации, введенной в МР. NA будет быстро замечен и легко изучен в нескольких xop диапазонах. Циты в более общем плане.

Эта модель обладает такими преимуществами, как простота с ее одиночными гигантскими клетками, а ее использование приводит к значительному количеству материала для биохимических экспериментов. Этот процесс также эффективен по времени по сравнению со стабильным генерированием клеточных линий. Это пособие может помочь ответить на ключевые вопросы в переводческих исследованиях, например, лучше понять роль конкретных областей факторов или изучить сплайсинг этих факторов.

Впервые мы добавили идею этого метода, когда хотели изучить влияние мутировавшего фактора инициации трансляции на синтез белка без интерференции транскрипции. Таким образом, мы избегаем потенциальных петель обратной связи между этими двумя механизмами. Действительно, расшифровки материалов хранятся и ставятся.

Трансляция может быть запущена с помощью прогестерона После дефекации, xus lavos цитов и получения CRN в соответствии с текстовым протоколом, используйте 10 x швабры и 6,6% формальдегида для литья 1,5% геля AROS. Подготовьте образцы в пробирке объемом 0,2 миллилитра с 8,8% формальдегида, 60 процентов для AMIDE объемом 0,1 из 10 х швабр и одним микролитром CRNA инкубируйте при температуре 70 градусов Цельсия в течение трех минут и положите пробирки на лед на 10 минут. Центрифугируйте образцы при 5 000 умноженных на G в течение нескольких секунд, прежде чем добавить два микролитра буфера для загрузки геля.

Запустите образцы при напряжении 90 вольт в течение 20 минут, чтобы не обращать внимания на гель. Замочите его в воде, не содержащей нуклеаз, на ночь. Затем проанализируйте его, чтобы проверить качество CNA.

Используйте спектрофотометр для определения концентрации CNA и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия для проведения микроинжекции РНК. Используйте среду ND 96 для заполнения соскобленной чашки Петри через один-два часа после дефолиации. Расположите циты вдоль скребковой дорожки в посуде.

Далее с помощью капиллярной микропипетки со сломанным наконечником, расположенной под углом 45 градусов. Вставьте кончик капилляра на глубину от 150 до 200 микрон в экваториальную зону ниже области пигментированного животного. Введите 30 нанограммов CRNA в 60 нанолитров в первую яйцеклетку.

Затем подождите от пяти до 10 секунд, прежде чем удалять капиллярный наконечник, чтобы предотвратить утечку образца. Для введения очередного цита вручную переместите чашку. Перенесите введенные циты в 24 луночные планшеты, заполненные тремя миллилитрами среды ND 96, и наведите их при температуре 19 градусов Цельсия, чтобы вызвать созревание митоза.

Инкубируйте ооциты в ND 96 с двумя микрограммами на миллилитр прогестерона или ПГ при 19 градусах Цельсия в течение 15 часов. Протестируйте эффект трансляции дикого типа EIF 4G и CRNA на мутантный фенотип в соответствии с текстовым протоколом. Определить степень распада зародышевых пузырьков под стереомикроскопом.

Подсчитайте количество зрелых цитов после стимуляции ПГ по наличию белого пятна на черном полюсе животного. Повторяйте подсчет каждый час до 24-го часа, чтобы провести западный анализ крови. Используйте движения наконечника микропипетки вперед и назад при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы гомогенизировать 10 цитов в 200 микролитрах показанного здесь буфера.

Центрифугируйте образцы при 10 000 G в течение 15 минут, чтобы извлечь цитоплазматическую фракцию в середине. Фазируйте верхнюю фракцию соответствующими липидами, а нижнюю – на клеточный мусор. Соберите цитоплазматическую фракцию и сохраните аликвоту для определения концентрации белка.

Объедините оставшееся в соотношении один к одному с хромым буфером или буфером выборки Бисса перед запуском страницы SDS и вестерн-блоттинга. Согласно текстовому протоколу. Чтобы провести поливентиляционный анализ, поместите пять цитов в одно условие в микропробирки объемом 1,5 миллилитра с одним миллилитром без нуклеазы и одним XPBS для промывки цитов.

Затем под вытяжным шкафом используйте набор для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя, чтобы изолировать РНК. После проверки целостности РНК и определения концентрации готовят две смеси лигирования для каждого условия CRNA со следующими реагентами к первой смеси. Добавьте РНК из нестимулированных пг цитов и во вторую смесь.

Добавьте РНК из стимулированных ПГ ооцитов. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, а затем при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 минут. Для инактивации фермента используют набор для обратной транскрипции CD NA.

Для каждого образца приготовьте смесь RT, указанную здесь. Добавьте 10 микролитров ранее приготовленной реакции лигирования и проведите ОТ в соответствии с инструкциями производителя после проведения ПЦР, используя следующую реакционную смесь и условия для каждой реакции при четырех микролитрах загрузочного буфера и пропустите по 10 микролитров каждого образца на 3%-ном геле агрос на 110 болтов. Наконец, анализируйте гель через 10 и 20 минут, чтобы наблюдать изменение размера, отражающее длину полиА-хвоста и, таким образом, созревание РНК, что является предпосылкой для их трансляции.

Как показано здесь, кинетическое созревание микрооцитов, вводимых в контрольных условиях, аналогично дикому типу, с аналогичным количеством ооцитов, подвергающихся РТБД через 12 и 24 часа после ПГ-стимуляции, через 24 часа после ПГ-стимуляции. Процент ооцитов, достигших зрелости, аналогичен как для дикого типа, так и для контрольной группы, вводимой водой и GFP, что указывает на то, что микроинъекции воды или контроля или EIF 4G одного CRNA оказали незначительное влияние на микроинъекцию миоза ооцитов с доминирующим отрицательным EIF 4G, однако, привели к резкому снижению GVBD даже после стимуляции PG. На этом рисунке показано, что дефект созревания может быть восстановлен у CRNA дикого типа по мере увеличения отношения дикого типа к доминантному отрицательному EIF 4G и одной CRNA.

То же самое можно сказать и о проценте цитов, которые созревают в соответствии с ожиданиями. В отсутствие стимуляции PG и сверхэкспрессии EIF 4G экспрессия эндогенного мха не обнаруживается: один доминирующий негатив оказывает незначительное влияние на эндогенный мох, что согласуется с предыдущими результатами. Кроме того, Aurora AEEG 2, которая действует перед индукцией мха, не показывает никаких признаков дерегуляции белка или его фосфорилированной формы, индуцированной после стимуляции PG.

И наоборот, фосфорилирование ИФК два, которое индуцируется мхом, ингибируется в присутствии доминирующего отрицательного EIF 4G. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет выполнить за пять дней, если она будет выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что не следует превышать 120 нанолитров КНК с концентрацией ниже определенных нанограммов после этой процедуры.

Хотя такой метод, как полисомное профилирование, может быть выполнен для ответа на дополнительный вопрос, например, определить, какая РНК может быть плохо или сильно транслирована.