Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать визуализацию в реальном времени и простые методы количественной оценки для анализа морфологии эпителиальных клеток эмбриона. Это достигается путем подготовки всех инструментов и оборудования. Вторым этапом процедуры является вырезание X explan из эмбрионов лягушек и размещение их в камерах для длительного культивирования.

Третьим этапом процедуры является сбор изображений эпителиальных клеток с высоким разрешением в режиме реального времени. Заключительным этапом процедуры является количественная оценка морфологических деталей эпителиальных клеток с помощью изображения J. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают отслеживаемые площади клеток и интенсивность мембран с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Здравствуйте, я Сагар Джоши из лаборатории Дэвидсона на факультете биоинженерии Университета Питтсбурга.

Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации живых клеток и количественного анализа эпителиальных клеток эмбриона Xenos lavia. Мы используем эту процедуру для изучения изменений цитоскелета клеток в режиме реального времени. Итак, приступим.

Чтобы подготовить камеры для выращивания крышек для животных с помощью силиконовой смазки, приклейте изготовленную на заказ акриловую камеру или маленькую нейлоновую шайбу к большому покровному стеклу размером 45 на 50 миллиметров. Добавьте в камеру один миллилитр 1% BSA с одной третью XMBS. Покрытие мелких осколков покрова этим же раствором выдерживают в течение двух-четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Чтобы уменьшить адгезию X explan к стеклу, промойте и заполните камеру средой DFA до тех пор, пока непосредственно перед переносом в The xs промойте фрагменты покровного стекла таким же образом. Затем погрузите их в чашку с эмбрионами культуры DFA, которые были микроинъецированы на стадии от одной до четырех клеток с желаемым MR NA до желаемой стадии через одну треть XMBS. С помощью переводной пипетки с наклонным отверстием перенесите эмбрионы в чашку с ДФА под препарирующим стереомикроскопом.

Используйте щипцы для извлечения эмбрионов для вырезания животного растения CapEx. Используйте петлю для волос для поддержки эмбриона в одном положении. С помощью ножа для волос сделайте небольшой надрез на шесте животного.

Делайте повторяющиеся плавные разрезы, чтобы расширить разрез и снять колпачок эктодермы. Акциз три или четыре х разъясните таким же образом. И с помощью переводной пипетки переместите их в подготовленную камеру для культуры.

С помощью петли для волос расположите каждый X эксплан так, чтобы эпителий был обращен ко дну камеры. С помощью щипцов. Держите в его центре фрагмент покровного листа.

Обмакните концы в силиконовую смазку. Поместите по одному фрагменту поверх каждого X эксплана. Слегка зафиксируйте каждый фрагмент на месте небольшими мазками силиконовой смазки.

Будьте осторожны, чтобы не разбить X explan с чрезмерной силой полностью. Заполните камеру DFA, покройте верхние края камеры силиконовой смазкой. Затем запечатайте верхнюю часть крышкой размером 24 x 40 миллиметров.

Отрегулируйте уровень DFA в камере, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха, и используйте салфетку, чтобы промокнуть любой перелив. Растения X теперь можно культивировать в течение длительного времени в герметичной камере в течение дня при комнатной температуре, переместив на место объектив конфокального микроскопа с 20-кратным увеличением. Поместите камеру с X-образным материалом на предметный столик микроскопа и установите на нее небольшие балансировочные грузы, чтобы удерживать ее в положении под светлым полем.

Отрегулируйте фокус и используйте позиционирование курса, чтобы визуализировать апикальные концы поверхностных ячеек. Переключитесь на флуоресценцию и объектив с более высокой мощностью. Чтобы собрать отдельные изображения или покадровые видеоролики экспланного эпителия, настройте сбор данных так, чтобы получить наилучшее возможное изображение.

Обратитесь к письменной части этого протокола для получения советов по настройке и визуализации. Поддержание мощности лазера на минимально возможном уровне. Делайте снимки или интервальные видеоролики эпителия x explan.

Обратитесь к письменной части протокола за предложениями по сбору данных. Файлы конфокальных изображений можно добывать для получения данных различными способами. Вот два примера того, как анализировать файлы данных с помощью программного обеспечения для анализа Image J с плагином bio formats.

Чтобы измерить площадь эпителиальной клетки, потяните вниз меню «Анализ» и выберите «Задать измерения». Выберите инструмент выбора на панели инструментов и наметьте ячейку в меню анализа, выберите инструменты, а затем диспетчер окупаемости инвестиций. Чтобы открыть менеджер областей интереса, нажмите кнопку управления t.

Чтобы добавить контур в менеджер ROI, выберите и добавьте столько контуров, сколько нужно. Затем нажмите «Сохранить», чтобы сохранить ROI, установленный в менеджере ROI. Нажмите измерить.

Теперь в окне результатов будут отображаться измеренные площади каждого ROI. Чтобы измерить интенсивность клеточной мембраны, выберите инструмент «Прямая линия» на панели инструментов изображения J. Проведите перпендикулярную линию поперек мембраны.

Нажмите CTRL T, как в предыдущем примере. Чтобы добавить выборку в менеджер ROI, откройте меню анализа и нажмите на профиль графика, чтобы создать график относительных интенсивностей по всей линии. Чтобы сохранить график в виде изображения, нажмите кнопку «Сохранить» в появившемся окне нового графика.

Потяните вниз меню списка, чтобы сохранить, затем сохраните, так как мы только что показали вам, как визуализировать и количественно оценить эмбриональные эпителиальные клетки из эксплана, иссеянного животного. Во время выполнения этой процедуры важно не забывать добавлять в DFA антибиотик и антибиотик. Чтобы предотвратить рост бактерий и грибков, будьте особенно осторожны при нажатии эксплантов под покровные стебли, потому что давление, превышающее необходимое, может разрушить эксплантацию.

Также важно помнить об оптимальных настройках конфокального микроскопа для получения изображений максимального качества. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.