Мышь наивного CD4 ⁺ Т-клеток Выделение и В пробирке Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Общая цель данной процедуры заключается в поляризации наивных CD-четырех положительных Т-клеток, выделенных из лимфатических узлов мыши, и селезенки в отдельные подгруппы Т-хелперов. In vitro это достигается путем первичной обработки селезенки и лимфатических узлов, собранных у взрослых мышей дикого типа. На втором этапе популяция CD-4 положительных клеток обогащается путем разделения магнитных гранул, а затем дополнительно сортируется по их наивной экспрессии маркеров Т-клеток.

На заключительном этапе клетки обрабатываются факторами, активирующими Т-клеточные рецепторы, и поляризующими цитокинами, чтобы индуцировать их дифференцировку в различные Т-хелперные линии. В конечном итоге проточная цитометрия. Для оценки эффективности дифференцировки Т-хелперных клеток используют Elis A и ПЦР в реальном времени.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Т-хелперов, например, как экспрессия определенных молекул или лечение определенными препаратами влияет на характер ответа Т-клеток. Начните с прикрепления конечностей 5-10-недельной мыши C 57 black six к препарирующей доске, а затем разрежьте кожу в продольном направлении от анального отверстия до подбородка, стараясь не проколоть подлежащую ткань брюшины. Затем прижмите кожу и используйте одну пару щипцов, чтобы захватить лимфатический узел, а другую — отделить ткань от каждого из мест, указанных на изображении.

Когда каждый лимфатический узел будет собран, поместите его в чашку для сбора, содержащую PBS с добавлением 1% FBS или PBS plus, а затем осторожно откройте брюшину и удалите селезенку. Поместите селезенку также в чашку для сбора и переложите чашку в ведро со льдом, чтобы обогатить CD четырьмя положительными клетками. Разделите лимфатические узлы в селезенке на две отдельные 60-миллиметровые чашки, содержащие три миллилитра PBS плюс каждая, с помощью стерильных щипцов.

Затем поместите квадрат стерильной нейлоновой сетки на селезенку и с помощью большого пальца поршня шприца осторожно прижмите их к сетке, пока почти вся ткань не перейдет во взвешенное состояние. Проведите суспензию вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить оставшиеся растворимые комки, а затем поместите новый кусок нейлоновой сетки на отверстие конической трубки объемом 15 миллилитров. Отфильтруйте суспензию в трубку, чтобы удалить оставшийся мусор.

Теперь повторите механическую диссоциацию для лимфатических узлов и заполните обе пробирки отфильтрованных клеток PBS plus. Затем несколько раз переверните трубки и поверните ячейки вниз. Повторно суспендируйте гранулу лимфатического узла в двух миллилитрах PBS.

Добавьте один миллилитр ледяного раствора КФК на каждую мышь в гранулу селезенки. Через одну минуту прекратите лизис эритроцитов с помощью 10 миллилитров PBS plus. Переверните трубку и снова поверните ячейки вниз.

Затем повторно суспендируйте гранулу селезенки еще в 10 миллилитрах PBS plus, добавьте клетки лимфатических узлов и уменьшите накопленную клеточную суспензию. На этот раз ресуспендируйте гранулу в 15 микролитрах CD и четырех магнитных шариках, разведенных в 85 микролитрах PBS плюс на каждую мышь в течение 15-30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем разведите клетки в 10 миллилитрах PBS plus.

Отфильтруйте суспензию через нейлоновое ситечко в новую 15-миллилитровую трубку и раскрутите ячейки вниз. Снова вкрутите гранулу в 100 микролитров PBS plus на мышь и положительно выберите для CD четыре положительные ячейки с помощью магнитного отбора шариков в соответствии с инструкциями производителя. После получения CD 4 положительной, положительной клеточной фракции, промойте клетки в 10 миллилитрах PBS плюс, чтобы отсортировать CD 4 положительную Т-клеточную фракцию.

Затем пометьте клетки соответствующими флуоресцентными антителами в течение 15-30 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте после мытья. Отфильтруйте помеченные ячейки, чтобы удалить любой мусор и перенесите их в факсимильную трубку на льду и защитите ее от света, отсортируйте CD 4 положительный, CD 25 отрицательный CD 62 L, положительный CD 44 отрицательный в полную среду RPMI. Когда все клетки будут собраны.

Промойте наивные Т-клетки в свежей, полноценной среде. Затем ресуспендируйте гранулу и завершите подсчет RPMI наивных Т-клеток и отрегулируйте концентрацию от одного умноженного на 10 до шести клеток на миллилитр, чтобы индуцировать in vitro дифференцировку Т-хелперного субпопуляции. Затем промойте каждую лунку из планшетов для клеточных культур, предварительно покрытых анти-CD-3 и анти-CD-28, в одном миллилитре стерильного FBS free PBS и планшете.

Наконец, клетки дополняют питательную среду соответствующими цитокинами и блокирующими антителами, как указано в таблице, и инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение четырех-пяти дней после четырех-пяти дней в культуре. Может быть выполнено внутриклеточное цитокиновое окрашивание четырех положительных Т-клеток CD из культур in vitro дифференцированного TH, TH двух индуцируемых treg и TH 17. Подтвердить, что каждое субпопуляция Т-клеток проявляет ожидаемый цитокиновый профиль.

Действительно, после 24-часовой рестимуляции анти-CD тремя EIS, A показывает, что субпопуляции также демонстрируют соответствующую внеклеточную продукцию внутриклеточных экспрессируемых цитокиновых белков. ПЦР в реальном времени для специфичных для линии факторов транскрипции дополнительно проверяет соответствующие профили транскрипционных факторов дифференцированных CD четырех положительных субпопуляций Т-клеток in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять и обрабатывать зеркальные клетки лимфатических узлов и селезенки для получения наивных CD четырех положительных Т-хелперов.

Кроме того, вы сможете дифференцировать эти Т-клетки в TH-один, TH-два, TH-17 или ireg-клетки.