В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии об активации Т-клеток, пролиферации и дифференцировке Th1, а также об антигенпрезентирующей клеточной стимуляции адаптивного иммунитета. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изучать среду in vivo и в то же время позволяет проводить манипуляции с клетками in vitro. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы выделения органов и костей и адаптационного переноса трудно освоить только с помощью текстовых инструкций.

Для выделения клеток костного мозга продезинфицируйте задние конечности взрослой мыши с помощью 70% этанола и с помощью ножниц сделайте боковой разрез кожи на задних конечностях. Вставьте ножницы в медиальную сторону ног, и разрежьте кожу ножницами до начала задних конечностей. Затем с помощью щипцов отделите кожу от ног.

С помощью ножниц отделите мышцу от бедренной и большеберцовой костей, а с помощью ножниц расчлените тазобедренный сустав, сломав головку бедренной кости. Затем отделите бедренную часть от большеберцовой кости, не ломая костных концов, и поместите кости в чашку Петри полного среднего размера на льду. Когда все кости будут собраны, осторожно отрежьте скальпелем проксимальный и дальний концы каждой кости и используйте шприц емкостью 1 миллилет, оснащенный иглой 25-го калибра, для многократной промывки костей общим объемом 10 миллилитров теплой полной среды RPMI.

Когда все кости будут промыты, переложите все содержимое чашки в коническую трубку на 50 миллилитров, оснащенную 70-микрометровым фильтром из нейлонового сета с порами, и осторожно удалите любой мусор и клеточные конгломераты с помощью осторожного перемешивания и пипетирования. Соберите клетки костного мозга с помощью центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре четырехградусного буфера для лизиса эритроцитов с помощью пипетирования и инкубируйте смесь на льду в течение пяти минут.

В конце инкубации прекратите лизис с помощью 10 миллилитров ПВС и повторно суспендируйте гранулу в 25 миллилитров полной среды для повторного центрифугирования. Затем повторно суспендируйте клетки в 5 миллилитров свежей готовой среды для подсчета и снова центрифугируйте клетки. Для выделения клеток вторичной лимфоидной ткани соберите паховые, подмышечные, плечевые, цервикальные и мезентарные лимфатические узлы и селезенку у трансгенных мышей OT-II и перенесите вторичные лимфоидные ткани в пластиковую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров полной среды RPMI.

Когда все ткани будут собраны, перенесите лимфатические узлы и селезенку в 70-микрометровый клеточный фильтр в конической трубке на 50 миллилитров и используйте поршень шприца для гомогенизации тканей. Промойте сетчатое фильтр до 15 миллилитров среды и раскрутите клетки путем центрифугирования. Затем изолируют CD4-положительные Т-клетки с помощью магнитной сортировки шариков, в соответствии со стандартными протоколами.

Для активации in vivo наивных CD4-положительных Т-клеток OT-II помечайте Т-клетки, изолированные магнитными шариками, жизненно важным клеточным индикаторным красителем в соответствии со стандартными протоколами и ресуспендируйте меченые клетки в соотношении от 10 до 6 клеток на 100 микролитров концентрации PBS. Затем адоптивно переносят 100 микролитров клеток на животное через хвостовую вену. Предварительно согрейте мышей перед инъекцией, чтобы убедиться, что хвостовые вены достаточно расширены для доставки всего объема клеток.

Через 24 часа доставьте от 10 до пятой ЛПС-зрелых OVA-пептидных дендритных клеток путем подкожной инъекции в подушечку стопы каждого введенного Т-клеточного животного. Через два и пять дней после усыновления у животных-реципиентов соберите подколенные лимфатические узлы у животных-реципиентов для обработки тканей и выделения Т-клеток, как показано на рисунке. Для анализа активации Т-клеток окрашивают выделенные на второй день клетки флуоресцентными антителами против CD4, CD69 и CD25 для определения процента CD64-положительных, CD25-положительных Т-клеток в популяции CD4-положительных реципиентов с помощью проточной цитометрии.

Для оценки пролиферации Т-клеток окрашивают выделенные на пятый день клетки соответствующими флуоресцентными антителами против CD4 и анализируют распад сигнала красителя жизненно важных клеток в донорской CD4-положительной популяции Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Для оценки дифференцировки Th1 проводят в планшете четыре раза по 10 до пятых суток пять изолированных Т-клеток в лунку в дозе 200 мкл полной среды, с добавлением иономицина и ФМА на лунку, в 96-луночный планшет. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия на шесть часов, добавляя брефельдин А в каждую лунку, чтобы блокировать секрецию цитокинов в течение последних четырех часов стимуляции.

В конце инкубации центрифугируйте планшет и выбросьте надосадочную жидкость путем быстрой инверсии. Окрашивают клетки анти-CD4 антителами с последующей фиксацией в 100 мкл 2%-ного параформальдегида и 1%-ной сахарозы в течение 20 минут при комнатной температуре. Проникните в клетки 50 микролитрами буфера для пермеабилизации в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, после чего промывайте центрифугированием 150 микролитрами PBS на лунку.

Далее окрашивают на интересующие внутриклеточные цитокины, согласно стандартным протоколам, в течение 30 минут при комнатной температуре, затем проводят два центрифугирования промывками по 150 мкл PBS с добавлением 1%-ного сапонина на лунку. Затем проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии. Проточный цитометрический анализ дендритных клеток костного мозга, полученных из GM-CSF, после стимуляции ЛПС выявил повышение регуляции маркеров созревания, таких как MHCII, CD80 и CD86.

Наивные CD4-положительные Т-клетки OT-II активируются после адоптивной передачи животным-реципиентам за счет повышения ими маркеров активации Т-клеток, поверхностной экспрессии и множественных раундов деления клеток. После активации пролиферирующие CD-положительные Т-клетки OT-II демонстрируют фенотип Th1, о чем свидетельствует их внутриклеточная экспрессия гамма-интерферона. После освоения этой техники она может быть выполнена за восемь часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать о подготовке всех реагентов и материалов за день до эксперимента. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению дендритных клеток и Т-клеток у мышей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять костный мозг из бедренных и большеберцовых костей мышей, и как переносить Т-клетки и дендритные клетки животным-реципиентам.

Не забывайте, что работа с острыми инструментами, такими как иглы, скальпели или ножницы, может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующей защиты пальцев.