Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Общая цель этой процедуры — показать, как изолировать и совместно культивировать развивающиеся тройничные ганглии и зачатки зубов. Это достигается путем первичной стерилизации, монтажа и нанесения покрытия на микрофлюидные устройства. Вторым шагом является вскрытие ганглиев тройничного нерва и зачатков зубов на определенной стадии развития у интересующей мыши.

Затем ганглии тройничного нерва и зачатки зубов помещаются в микрофлюидные устройства и совместно культивируются. Заключительным этапом является фиксация клеток и их окрашивание с помощью иммунофлюоресценции. В конечном счете, микроскопия используется для того, чтобы показать картину иннервации, которая является результатом совместного культивирования.

Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как обычные кокультуры, заключается в том, что этот метод позволяет проводить совместное культивирование различных органов и тканей каждый в своей оптимальной культуре. Терпимая. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области искусственных инноваций, такие как роль различных молекул в инновациях в зубах и правило инноваций в развитии зубов. Начните с автоклавирования инструментов для препарирования, которые включают в себя пару микродиссекционных щипцов и пару ножниц.

Далее простерилизуйте партию стеклянных крышек размером 24 на 24 миллиметра, поместив их в раствор одного моляра соляной кислоты на орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа. Затем промойте чехлы три раза стерильной дистиллированной водой, затем три полоскания в 99% этаноле, высушите их под стерильной вытяжкой, как только высохнет, включите на вытяжке ультрафиолетовый свет на 30 минут. Затем храните крышки в 70% этаноле до тех пор, пока они не понадобятся.

Затем с помощью стерильных щипцов осторожно извлеките микрофлюидные устройства для выделения аксонов из упаковки и поместите их в стерильную чашку Петри с помощью стерильного одномиллиметрового биопсийного перфоратора. Создайте по одному отверстию в приборах для каждого образца. В переписке с камерами культуры.

Будьте осторожны, не пробивайте слишком близко к микроканавкам, так как они могут быть повреждены давлением. Затем простерилизуйте устройства, поместив их в 70% этанол. Позаботьтесь об удалении всего захваченного воздуха.

Затем извлеките приборы из этанола и полностью высушите их под стерильным вытяжным колпаком. Кроме того, снимите защитные стекла с 70% раствора этанола и дайте им высохнуть под стерильным вытяжным колпаком. Подождите не менее трех часов, прежде чем продолжить.

Поместите каждую крышку в углубление в шестилуночной пластине. Затем поместите микрофлюидное устройство на защитное стекло и аккуратно, но сильно надавите щипцами, чтобы обеспечить полное сцепление между изолирующим устройством и стеклянной крышкой. Далее пипеткой по 150 микролитров по 0,1 миллиграмм на миллилитр, поли Д лицин вводят в каждую из камер для культивирования.

Затем поместите микрофлюидные устройства в вакуум на пять минут, чтобы удалить весь воздух из камер. Если воздух все еще можно увидеть внутри камер. Поместите раствор поли D лизина в камеры.

Инкубируйте устройства с поли де лизином в течение ночи при 37 градусах Цельсия на следующий день. Вымойте камеры три раза стерильной дистиллированной водой, а затем заполните камеры 150 микролитрами пяти микрограмм на миллилитр, рабочим раствором ламина, и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Затем восстановите среду для ганглиев тройничного нерва и культур зародышевых зубов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Очистите область вскрытия и стереоскоп этанолом 70% и поместите инструменты для вскрытия после жертвоприношения. Рассеките кожу вокруг нижней части живота беременной мыши с эмбрионами мышей стадии от E 14.5 до E 17.5. Затем осторожно вскройте брюшную полость с помощью ножниц.

Найдите матку, удалите ее и поместите в трубку, наполненную льдом. Cold PBS препарирует эмбрионы и помещает их по отдельности в новую чашку Петри, наполненную ледяным PBS. После того, как все эмбрионы будут удалены из лишних эмбриональных тканей, обезглавьте их с помощью ножниц.

Отделите нижнюю челюсть от остальной части головы с помощью микродиссекции, ножниц, стараясь не повредить ганглии тройничного нерва. Далее возьмите голову и поместите ее на охлажденную стеклянную чашку Петри. Используйте щипцы для удаления кожи и черепа.

Затем поместите щипцы ниже головного мозга и поднимите. Чтобы удалить головной мозг и мозжечок, локализуйте ганглии тройничного нерва и с помощью щипцов и игл для рассечения отделите ганглии тройничного нерва от тройничных нервов и очистите ганглии. Законсервируйте их в холодном PBS, используя в качестве ножей иглы для препарирования.

Удалите язык и кожу вокруг челюсти. Разделите левую и правую получелюсти, разрезав по средней линии челюсти. Затем найдите зачатки зубов и изолируйте их с помощью игл для препарирования после вскрытия ганглиев тройничного нерва и зачатков зубов, удалите ламинин из микрофлюидных устройств и заполните камеры 200 микролитрами соответствующей среды.

С помощью щипцов аккуратно перенесите рассеченные ганглии тройничного нерва и зачатки зубов в отверстия, созданные с помощью биопсийного перфоратора. Следите за тем, чтобы зародыши зубов не плавали и тонули до тех пор, пока не соприкоснутся с покровными стеклами. Культуру, образцы помещают в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Меняйте питательную среду каждые 48 часов в течение 10 дней, чтобы сменить среду. Сначала удалите среду, направив пипетку к внешней стороне лунок. Затем добавьте свежую предварительно прогретую среду со стороны велсов, расположенных напротив камер в период культивирования.

Визуализируйте сокультуры в любое время с помощью световой микроскопии. После периода культивирования промойте камеры, пипетируя 150 микролитров PBS в одну лунку на камеру и пропуская PBS через камеры. Повторите стирку в общей сложности три раза после последней стирки.

Извлеките PBS и зафиксируйте образцы, пипетируя 150 микролитров 4%-ного параформного альдегида PBS в одну лунку на камеру и позволяя ему течь в другую камеру. Инкубируйте устройство при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем дважды промойте камеры PBS и приступайте к дальнейшему анализу, такому как иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация выроста.

Во время выращивания угля нейриты из ганглиев тройничного нерва ответвляются из своего культурного отсека и распространяются к развивающемуся зародышу зуба. При большем увеличении можно увидеть, как нейриты проходят через аксональные камеры и микробороздки в микрофлюидном устройстве. Прогресс роста нервов можно проследить с течением времени, чтобы описать развитие инноваций.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как РНК или протеинизация, чтобы изучить, например, изменения экспрессии генов или секреции белка в тканях-мишенях после инновации.