Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ выделения и совместного культивирования развивающихся тройничных ганглиев и зубных зачатков. Для этого сначала проводят стерилизацию, монтаж и покрытие микрофлюидных устройств. Вторым этапом является выделение тройничных ганглиев и зубных зачатков из мышей соответствующей стадии развития.

Затем тройничные ганглии и зубные зачатки помещают в микрофлюидные устройства для совместного культивирования. Заключительным этапом является фиксация клеток и их окрашивание методом иммунофлуоресценции. В итоге с помощью микроскопии демонстрируют характер иннервации, сформировавшийся в результате совместного культивирования.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как традиционное совместное культивирование, является то, что она позволяет осуществлять кокультивирование различных органов и тканей, каждая из которых находится в своей оптимальной питательной среде. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инноваций в стоматологии, такие как роль различных молекул в инновациях зубов и роль инноваций в развитии зубов. Начните с автоклавирования инструментов для диссекции, в число которых входят микродиссекционный пинцет и ножницы.

Затем стерилизуйте партию стеклянных покровных стекол размером 24 мм на 24 мм, поместив их в раствор 1 M соляной кислоты на орбитальный шейкер при 37 °C на 24 часа. После этого трижды промойте покровные стекла стерильной дистиллированной водой, затем трижды ополосните в 99% этаноле и высушите их под стерильным ламинарным потоком; после высыхания включите УФ-лампу в боксе на 30 минут. Затем храните покровные стекла в 70% этаноле до их использования.

Затем с помощью стерильного пинцета осторожно извлеките микрофлюидные устройства для изоляции аксонов из упаковки и поместите их в стерильную чашку Петри, используя стерильный биопсийный панч диаметром 1 мм. В устройствах сделайте по одному отверстию для каждого образца, напротив камер для культивирования.

Будьте осторожны, чтобы не делать проколы слишком близко к микроканавкам, так как они могут быть повреждены давлением. Затем стерилизуйте устройства, погрузив их в 70% ethanol, стараясь удалить весь попавший внутрь воздух.

Затем извлеките устройства из этанола и полностью высушите их в стерильном ламинарном шкафу. Также извлеките покровные стекла из 70% этанола и дайте им высохнуть в стерильном ламинарном шкафу. Перед тем как продолжить, подождите не менее трех часов.

Поместите каждое покровное стекло в лунку планшета на шесть лунок. Затем установите микрофлюидное устройство на покровное стекло и осторожно, но плотно прижмите его пинцетом, чтобы обеспечить полную адгезию между устройством для изоляции и стеклом. Далее дозированно внесите по 150 µL поли-D-лизина в концентрации 0,1 mg/mL в каждую из культуральных камер.

Затем поместите микрофлюидные устройства в вакуум на пять минут, чтобы удалить весь воздух из камер. Если в камерах всё еще видны пузырьки воздуха, повторно введите раствор поли-D-лизина в камеры.

Инкубируйте устройства с поли-D-лизином в течение ночи при 37 °C. На следующий день трижды промойте камеры стерильной дистиллированной водой, затем заполните камеры 150 µL рабочего раствора ламинина в концентрации 5 µg/mL и инкубируйте их в течение ночи при 37 °C. Затем приготовьте среды для культур тройничных узлов и зубных зачатков, как описано в прилагаемом текстовом протоколе.

Очистите зону диссекции и стереомикроскоп 70% этанолом, затем подготовьте инструменты для диссекции после усыпления животного. Выполните разрез кожи вокруг нижней части живота беременной мыши с эмбрионами на стадии развития от E 14.5 до E 17.5. Затем осторожно вскройте брюшную полость с помощью ножниц.

Найдите матку, извлеките её и поместите в пробирку со льдом. С помощью холодного PBS выделите эмбрионы и перенесите их по отдельности в новую чашку Петри, заполненную ледяным PBS. После того как все эмбрионы будут отделены от внезародышевых тканей, проведите их декапитацию с помощью ножниц.

Отделите нижнюю челюсть от остальной части головы с помощью микродиссекционных ножниц, стараясь не повредить тройничные ганглии. Затем возьмите голову и поместите ее в охлажденную стеклянную чашку Петри для диссекции. С помощью пинцета удалите кожу и кости черепа.

Затем поместите пинцет под цефалон и приподнимите его. Чтобы удалить цефалон и мозжечок, локализуйте тройничные ганглии, после чего с помощью пинцета и диссекционных игл отделите тройничные ганглии от тройничных нервов и очистите ганглии. Поместите их в холодный PBS, используя диссекционные иглы в качестве ножей.

Удалите язык и кожу вокруг челюсти. Разделите левую и правую половины челюсти, разрезав ее по срединной линии. Затем найдите зачатки зубов и изолируйте их с помощью диссекционных игл; после препарирования тройничных ганглиев и зачатков зубов удалите ламинин из микрофлюидных устройств и заполните камеры 200 µL соответствующих сред.

С помощью пинцета аккуратно перенесите препарированные тройничные ганглии и зубные зачатки в отверстия, проделанные биопсийным панчем. Убедитесь, что зубные зачатки не плавают, а опускаются до соприкосновения с покровными стеклами. Культивируйте образцы в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide.

Меняйте культуральную среду каждые 48 часов в течение 10 дней. Сначала удалите среду, направив пипетку к внешней стороне лунок. Затем добавьте свежую предварительно подогретую среду в ту часть лунок, которая расположена напротив камер, на протяжении всего периода культивирования.

Проводите визуализацию кокультур в любое время с помощью световой микроскопии. По окончании периода культивирования промойте камеры, пипетируя 150 µL PBS в одну лунку каждой камеры и позволяя PBS протечь через камеры. Повторите промывку всего три раза после последнего этапа промывки.

Удалите PBS и зафиксируйте образцы, внеся пипеткой 150 µL 4% параформальдегида в PBS в одну лунку каждого канала, позволяя раствору перетечь в другой канал. Инкубируйте устройство при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем дважды промойте каналы PBS и переходите к дальнейшему анализу, такому как иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация разрастания клеток.

В процессе совместного культивирования нейриты тройничных ганглиев разрастаются из своего культурального отсека и направляются к развивающемуся зубному зачатку. При большем увеличении видно, как нейриты проходят через аксональные камеры и микроканавки микрофлюидного устройства. Прогресс роста нервов можно отслеживать с течением времени для описания развития иннервации.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ РНК или определение содержания белков, чтобы изучить, например, изменения экспрессии генов или секреции белков в целевых тканях после инокуляции.