Генерация нервно-мышечных соединений с помощью микрофлюидного устройства

Начните с микрофлюидного устройства с полимерным покрытием, состоящего из соединенных между собой лунок с зеркальными отсеками, соединенными через микроканавки.

Засейте нервные клетки-предшественники в лунки одного компартмента.

Позвольте им мигрировать во взаимосвязанный канал и прилипнуть к полимеру.

Наложите питательную среду для стимулирования созревания нейронов в моторные нейроны.

В противоположном отсеке засейте лунки мышечными клетками-предшественниками, которые мигрируют и прилипают к соединенному между собой каналу.

Замените среду средой для дифференцировки, индуцируя слияние мышечных клеток-предшественников и образуя многоядерные мышечные клетки.

Добавьте в компартмент, содержащий мышечные клетки, среду для дифференцировки нейронов, содержащую факторы роста.

Тем временем добавьте половину объема среды, не содержащей фактора роста, в компартмент, содержащий нервные клетки.

Факторы роста и больший объем среды в противоположном отсеке способствуют тому, что моторные нейроны расширяют свои отростки через микробороздки.

Эти нейронные процессы затем соединяются с мышечными клетками, образуя нервно-мышечные соединения.

Чтобы поместить нейральные клетки-предшественники, или NPC, в микрофлюидное устройство, удалите DPBS из двух лунок с одной стороны микроканавок в устройстве с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Чтобы засеять в общей сложности 250 000 NPC в 60-100 микролитрах среды 10-го дня для каждого устройства в верхней правой лунке, засейте половину клеточной суспензии близко к отверстию канала под углом 45 градусов.

Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы позволить клеточной суспензии протекать через канал, прежде чем добавить оставшуюся половину клеточной суспензии в нижнюю лунку. С помощью ручки отметьте засеянную сторону как NPC или эквивалент для удобства ориентации устройства без микроскопа и инкубируйте в течение пяти минут для прикрепления клеток. Затем медленно долейте две лунки, засеянные NPC, дополнительной средой для моторных нейронов на 10-й день до общего объема 200 микролитров на лунку. С помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите DPBS из двух лунок с другой стороны микробороздок, противоположных только что посеянным NPC.

Добавьте в незасеянные лунки 200 микролитров среды двигательных нейронов за день 10 на лунку. Затем добавьте 6 миллилитров DPBS на 10-сантиметровую посуду вокруг устройства, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации.

Чтобы сменить среду, медленно удаляйте среду в обеих лунках с помощью NPC, расположив наконечник пипетки объемом 200 микролитров на нижнем крае стенки лунки напротив отверстия канала. Чтобы сильный поток среды не повредил клетки в канале, медленно добавляйте от 50 до 100 микролитров свежей среды двигательных нейронов в каждую лунку, непрерывно меняя между верхней и нижней лункой. Повторяйте процесс до тех пор, пока в каждой лунке не будет по 200 микролитров среды.

На 17-е сутки дифференцировки мотонейронов удалите среду мотонейронов на незасеянной стороне микробороздок в аппарате с помощью пипетки объемом 200 микролитров и промойте лунки DPBS. Засейте в общей сложности 200 000 первичных мезоангиобластов человека или МАБ в 60-100 микролитров питательной среды на устройство, засеяв половину клеточной суспензии в верхнюю лунку.

Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы позволить клеточной суспензии протекать через канал, прежде чем засевать оставшуюся половину клеточной суспензии в нижнюю лунку, как было продемонстрировано ранее для осаждения NPC. Инкубируйте устройство в течение пяти минут для прикрепления клеток. Затем долейте в две только что засеянные MAB лунки дополнительной питательной средой и снова инкубируйте, как показано на рисунке.

Для начала хемотаксического и объемного градиента на 21-е сутки дифференцировки моторных нейронов необходимо добавить в компартмент миотрубки 200 микролитров на лунку базальной среды моторных нейронов, содержащей факторы роста. Затем добавьте 100 микролитров на лунку базальной среды мотонейронов без факторов роста в компартмент моторных нейронов.