Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Общая цель этого протокола — продемонстрировать универсальный подход к разработке гидрогелевых биочернил, которые можно экструдировать с помощью устройств биопечати. Затем биочернила могут быть использованы для изготовления трехмерных тканевых конструкций. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биопечати, например, как контролировать механические свойства, необходимые для получения материала, который можно экструдировать с помощью биопринтера.

Основное преимущество этой технологии заключается в том, что мы используем коммерчески доступные компоненты, объединенные модульным образом, для создания простых и эффективных биопечатных гидрогелевых биочернил. Применение этих технологий включает в себя создание 3D-тканевых органоидов, которые могут быть использованы для точного моделирования эффектов лекарств, токсинов и болезней. Хотя этот метод может обеспечить основу для биопечати 3D-конструкций печени, он также может быть применен к другим типам тканей, таким как мышцы, легкие и толстая кишка.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что существует ряд различных реагентов, используемых для создания гидрогелевых биочернил, но на самом деле это довольно просто. Демонстрировать процедуру будет Ён Джун Соль, постдок нашей команды. Для начала приготовьте тканеспецифичный расщепление внеклеточного матрикса для использования в гидрогелевой формуле, как описано в другом месте.

Затем растворите фотоинициатор в воде в соотношении массы к объему 0,1%Чтобы получить биочернила гидрогеля, сначала растворите компоненты основного материала из наборов гидрогеля гиалуроновой кислоты в отдельные аликвоты раствора фотоинициатора воды. Затем смешайте раствор ВКМ, 2% тиолированную гиалуроновую кислоту, 2% тиолированный желатин, сшивающие агенты и питательные среды гепатоцитов в показанных здесь соотношениях. Чтобы улучшить экструзионные свойства биочернил, добавьте в смесь 1,5 миллиграмм на миллилитр немодифицированной гиалуроновой кислоты и 30 мг на миллилитр желатина.

полученную смесь на высокую мощность в течение десяти секунд перед использованием. Перед тестированием биочернил в устройстве биопечати сначала проверьте характеристики экструзии на лабораторном стенде. С помощью стандартного шприца капните образец биочернил, а затем прикрепите к шприцу иглу 20-30 калибра.

Дайте биочернилам сшиться, а затем протолкните биочернила через иглу, чтобы получить гладко экструдированные гидрогелевые нити. Если рецептура способна создать нить с небольшим количеством неровностей или без них, то она готова к биопечати. Чтобы загрузить препараты биочернил в биопринтер, пипетируйте их пипеткой в стерилизованные картриджи принтера.

Дайте им постоять 30 минут перед экструзией, так как биочернила подвергнутся первому этапу спонтанного сшивания внутри картриджа. Далее загрузите картридж в установку для печати и подключите к картриджу пневматический источник давления. Подготовьте простую выкройку, как эта сетка семи на семь миллиметров с параллельными линиями, для печати, чтобы оценить ее совместимость с экструзией.

В то время как печатающая головка движется в плоскости XY со скоростью примерно 300 миллиметров в минуту, приложите давление 20 килопаскаль к картриджу, чтобы выдавить биочернила. Если экструдированные материалы комковатые или неровные, уменьшите количество добавляемого сшивающего агента, чтобы размягчить сшитый материал первой стадии. Правильно приготовленный состав биочернил должен выдавливаться плавно, что обеспечивает точное осаждение и архитектуру.

Получите 3D первичные клеточные сфероиды печени в 96-луночном планшете методом висячих капель, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. После трех дней в культуре соберите сфероиды печени из подвесной капельной пластины с помощью пипетки и перенесите их в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Дайте сфероидам осесть на дно конической трубки в течение одной-двух минут.

Затем тщательно отсасывайте среду с помощью пипетки. Перенесите от 110 до 125 процентов от желаемого объема напечатанной 3D-конструкции свежеприготовленного раствора гидрогелевых биочернил на коническую трубку, содержащую сфероиды. Затем осторожно пипетируйте сфероиды вверх и вниз, чтобы снова суспендировать их в растворе гидрогелевых биочернил.

После равномерной суспензии перенесите раствор сфероида в картридж биопринтера с помощью пипетки и дайте раствору пройти первую стадию сшивания в течение 30 минут. После этапа сшивки с помощью биопринтера необходимо создать желаемые гидрогелевые структуры, содержащие первичные сфероиды печени. После нанесения каждого слоя подвергайте напечатанные биочернила воздействию ультрафиолетового света в течение двух-четырех секунд, чтобы запустить механизм вторичной сшивки.

Это позволит стабилизировать конструкции и повысить жесткость до нужного уровня. Концентрация алкина ПЭГ в растворе контролирует общую плотность сшивки и, следовательно, в первую очередь контролирует жесткость конечной конструкции. После биопечати с помощью конфокальной микроскопии наблюдалась высокая жизнеспособность клеток в конструкциях печени.

Кроме того, когда конструкции окрашивали на маркеры, указывающие на ткань печени, наблюдалась положительная экспрессия CYP3A4, изоформы цитохрома Р450, внутриклеточного альбумина, E-кадгерина, белка адгезии эпителиальных клеток-клеток и DPP4, белка с высокой экспрессией в печени. Когда питательные среды были протестированы на уровни мочевины и альбумина, было обнаружено, что конструкция секретирует как мочевину, так и альбумин на постоянных уровнях в течение 14 дней. Это также говорит о том, что тканеспецифичные гидрогелевые биочернила помогают поддерживать функцию клеток печени.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два часа от начала до конца, если она выполнена правильно. Однако это часто зависит от конкретного используемого устройства биопечати. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что продемонстрированные шаги часто должны быть адаптированы для совместимости с другими типами тканей или устройствами биопечати.

После этой процедуры могут быть созданы другие составы гидрогелевых биочернил для поддержки биопечати других типов тканей. Развитие этих технологий помогло проложить путь к созданию мультиорганоидных платформ «тело на чипе» для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, с чего начать проектирование материалов, которые можно использовать для биопечати 3D-конструкций тканей с использованием многоступенчатой сшивки.

Не забывайте, что работа с ультрафиолетовым светом может быть чрезвычайно опасной для зрения, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков от ультрафиолета.