Одновременная Двухфотонное В Vivo Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

Все описанные ниже экспериментальные методики были одобрены Местным этическим комитетом при Институте эмпирической биологии им. Ненски Польской академии наук. В этом видео показана процедура трепанации черепа, которая позволяет визуализировать нейроны в ретроспленальной коре головного мозга мышей с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в трансгенной линии стоп с перегрузкой в одну G. Этот подход сочетается с инъекцией аденоассоциированного вируса mCherry, экспрессирующего аденоассоциированный вирус, AAV, в дорсальный гиппокамп.

В сочетании эти методы позволяют осуществлять долгосрочный мониторинг переживаемой зависимости, структурной пластичности в ретроспленальной коре. В данной работе мы предлагаем имплантацию краниального окна над ретроспленальной корой как не являющуюся возможной областью интереса для двухфотонной микроскопии in vivo. Чтобы визуализировать морфологические изменения в нейронных структурах, мы использовали 1-G мышей B с экспрессией флуоресцентного белка GFP примерно в 10 процентах нейронов мозга.

Еще одним новшеством, которое мы предлагаем, является инъекция AAV, экспрессии флуоресцентного белка mCherry под нейрон-специфичным промотором, в более глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, чтобы визуализировать проекции структуры в ретроспленальную кору. Простерилизуйте все инструменты, стеклянные емкости для жидкостей и ватные палочки в автоклаве. Вам нужны перчатки.

Очистите операционный стол, стереотаксическую раму и все окружающее пространство 70% этанолом. Используйте стерильную хирургическую прокладку, чтобы создать стерильное пространство для всего стерилизованного оборудования. Нарежьте гелевую пену на небольшие кусочки и замочите их в стерильном физрастворе.

Поместите животное в индукционную камеру и установите уровень изофлурана на 5% и подачу кислорода на два литра в минуту. Эта процедура должна занять около трех минут. Выньте животное из индукционной камеры.

Используйте зажимы для хвоста или пальцев ног, чтобы убедиться, что животное полностью успокоено. С помощью точных триммеров сбрейте волосы от затылка, между ушами, до глаз. Поместите животное в стереотаксическую рамку и стабилизируйте голову с помощью ушных планок.

Установите уровень анестезии от 1,5 до 2% изофлурана и ноль целых три целых литра кислорода в минуту. Нанесите глазную мазь. Вводите животному подкожно толфедин, четыре миллиграмма на килограмм, бутомидор, два миллиграмма на килограмм, и байтрил, пять миллиграммов на килограмм, чтобы предотвратить воспаление, боль и инфекцию соответственно.

Введите животному внутримышечно дексаметазон, ноль целых две десятых миллиграмма на килограмм, чтобы предотвратить отек мозга. Очистите кожу стерильными ватными тампонами с бетадином и 70% этанолом. Смените перчатки и распылите на них 70% этанола.

Подтяните кожу с помощью щипцов и с помощью микроножниц надрежьте кожу горизонтально вдоль основания головы, а затем наискось к передней точке между глазами. Снимите кожный лоскут. Нанесите мазь с лидокаином стерильным тампоном на надкостницу, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение и боль.

Используйте стерильные ватные тампоны или скальпель для удаления надкостницы. Подсушите череп стерильными тампонами. С помощью стерильной иглы нанесите на края кожи плотный цианоакрилатный клей, чтобы обездвижить их и предотвратить дальнейший контакт со стоматологическим цементом.

Подождите, пока клей высохнет. Наложите стерильное трехмиллиметровое покровное стекло на череп спереди от лямбдоидного шва. Центрировать покровное скольжение по ретроспленальным координатам, переднее, заднее брегмо минус два целых восемь десятых, медиальная латеральная брегма ноль.

Отметьте края скольжения крышки, поцарапав поверхность черепа стерильной иглой. Поместите покровное стекло обратно в стерильную емкость с 70% этанолом. Используйте высокоскоростную стоматологическую бормашину с бором малого диаметра, чтобы очертить круг диаметром три миллиметра.

Очистите место сверления от костной пыли стерильными тампонами с солевым раствором. Используйте гелевую пену и тампоны, чтобы остановить периодическое кровотечение и очистить кость. В перерывах между сверлением проверьте толщину кости тонкими щипцами, осторожно касаясь костного круга и проверяя его подвижность.

Имея в виду, что в области швов кость толще. Прекращайте сверление, когда костный круг станет подвижным и на окружности останется только ровный тонкий слой кости. Очистите операционное поле от оставшейся костной пыли тампонами с солевым раствором.

Капните стерильный физиологический раствор на место сверления, накрыв просверленный круг. Осторожно подденьте костный круг тонкими щипцами, а затем аккуратно, но твердо удалите кость, подняв ее вверх. Будьте осторожны, чтобы не перекосить костный круг во время его подъема, чтобы предотвратить возможное повреждение твердой мозговой оболочки.

Аккуратно нанесите гелевую пену, смоченную в стерильном физрастворе, на твердую мозговую оболочку, чтобы помочь остановить кровотечение. Дождитесь, пока все кровотечения полностью остановятся. Аккуратно снимите гелевую пену, чтобы не нарушить процесс свертывания.

Обратите внимание, что область швов сильно васкуляризирована, поэтому кровотечение на этом этапе может оказаться глубоким. Важно дождаться достаточного времени, чтобы кровотечение остановилось. Подсоедините инфузионный насос к стереотаксической башне и подключите контроллер.

Вставьте иглу 35-го калибра в шприц для наполнения. Промойте шприц 10 раз этанолом, чтобы стерилизовать его, и 10 раз стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить следы этанола. Удалите пузырьки воздуха из шприца.

Вставьте шприц в насос. Залейте одну дозу препарата AV и держите его на льду. Наполните шприц раствором вируса.

Центрируйте иглу на брегме, а затем аккуратно введите в гиппокамп, используя следующие координаты: передний, задний минус два, медиальный латеральный плюс минус один, дорсальный вентральный минус один. Эти координаты будут расположены у края краниальной области. Подождите пять минут, чтобы ткань стабилизировалась.

Введите ноль целых семь микролитров AV раствора со скоростью 50 нанолитров в минуту. Подождите 10 минут, чтобы вирус полностью впитался. Аккуратно извлеките иглу.

Промокните гелевой пеной, если возникло кровотечение. Повторите то же самое с контралатеральной стороной. Уложите стерильное сухое покровное стекло на верхнюю часть твердой мозговой оболочки в просверленную круглую рамку.

Держите покровное стекло форцепсом, чтобы аккуратно расплющить твердую мозговую оболочку и приблизить края покровного стекла к поверхности черепа. С помощью стерильной иглы нанесите плотный цианоакрилатный клей на края покровного стекла, чтобы прикрепить их к черепу. Подождите, пока клей высохнет.

В переднюю часть черепа поместите фиксирующую планку, гайку или изготовленную на заказ конструкцию. Обратите внимание, что фиксирующая планка должна быть размещена в положении, позволяющем горизонтально расположить краниальное окно во время сеанса визуализации. Нанесите клей на края бруска.

Подождите, пока клей высохнет. Обратите внимание, что планка фиксации должна располагаться как можно дальше от окна. Если он расположен слишком близко к окну, стержень и винт, соединяющий его с изготовленным на заказ держателем, могут стать препятствием для объектива в процессе съемки.

Приготовьте стоматологический акрил и нанесите его на поверхность черепа вокруг стекла. Полезно сформировать вокруг окна кратерообразную форму. Он создаст полость для воды, которая будет нанесена позже для визуализации с помощью водяного объектива.

Создайте колпачок из стоматологического акрила, закрывающий остальную операционную зону кожей с краями фиксатора планкой, укрепляющей кратер вокруг черепного окна. Подождите, пока стоматологический цемент застынет. Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в камеру восстановления.

Подождите, пока животное восстановится после операции, наблюдая за физиологическими функциями. Применяйте послеоперационную анестезию циропроферрином, 10 миллиграммов на килограмм, и лечение антибиотиками байтрилом, 5 миллиграммами на килограмм, в течение 48 часов. Запустите сапфировый лазер ti, включите микроскоп.

Система, используемая в этом эксперименте, оснащена двухфотонным лазером, системой ОПО и фальсифицированной ФЭУ с двойным арсенидом галлия. Поместите животное в индукционную камеру и индуцируйте анестезию. Извлеките животное из индукционной камеры и поместите в маску для газовой анестезии под микроскопом.

Уменьшите подачу кислорода до нуля целых трех десятых литров в минуту и концентрацию изофлурана до 1,52%Закрепите животное на индивидуальной раме микроскопа с помощью винта МТ или другой специальной системы. Выровняйте окно черепа. Обратите внимание, что возможно использование системы фиксации головы производителя микроскопа, хотя конкретная кастомная рамка дает лучшие результаты, улучшенную устойчивость головы, постоянное позиционирование при многократных сеансах во время хронического эксперимента.

Используя настройки широкоугольного микроскопа, объектив с малым увеличением, центрируйте изображение на одной из сторон ретроспленальной коры и сфокусируйте его на поверхности покровного скольжения. Нанесите каплю воды в кратерообразную акриловую лунку. Переключитесь на цель погружения в воду на дальние расстояния.

Перемещайте объектив к краниальному окну до тех пор, пока водяной мениск не соединит образец и цель. Переключитесь на двухфотонную настройку и начните сканирование образца сверху вниз с минимальным зумом. Пересечение твердой мозговой оболочки будет видно в виде бликов высокого неспецифического сигнала.

Отрегулируйте настройки сбора данных микроскопом в обоих каналах, GFP и mCherry в соответствии с мощностью сигнала от флуоресцентных клеток, чтобы охватить весь динамический диапазон. После нахождения подходящего нейрона с дендритным деревом, отделенным от других клеток, выполните первоначальное сканирование, используя только фильтры GFP, установленные с наименьшим масштабированием и расстоянием Z в пять микрон. Получите максимальную проекцию стека сканирования и распечатайте его для аннотаций с использованием инвертированных цветов.

Установите зум на значение, которое позволит отобразить нужные морфологические детали. Сфотографируйте все дендритное дерево в GFP и канале mCherry, используя максимальную проекцию в качестве ориентира. Используя этот протокол, можно будет многократно контролировать как пре, так и постсинаптические структуры в ретроспленальной коре.

Этот подход может быть использован в хроническом эксперименте, в котором поведенческие манипуляции, как ожидается, будут коррелировать при изменении морфологии дендритов, синаптических шипиков или пресинаптических нейтронов. Сеансы визуализации могут проводиться с любой частотой, но 24-часовой интервал предпочтительнее, чтобы обеспечить надлежащее восстановление животного и свести к минимуму эффект анестезии. При правильном применении эта методика позволяет проводить несколько сеансов визуализации в течение нескольких месяцев.