Одновременная Двухфотонное

Все описанные ниже экспериментальные процедуры были одобрены местным этическим комитетом Института экспериментальной биологии имени Ненцкого Польской академии наук. В данном видео представлена процедура краниотомии, которая позволяет осуществлять хроническую визуализацию нейронов в ретроспленальной коре мыши с помощью двухфотонной микроскопии in vivo на трансгенной линии one-G of feet. Этот подход сочетается с инъекцией аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессирующего mCherry, в дорсальный гиппокамп.

В совокупности эти методы позволяют осуществлять долгосрочный мониторинг сформированной зависимости и структурной пластичности в ретросплениальной коре. В данной работе мы предлагаем имплантацию краниального окна над ретросплениальной корой как подходящую область интереса для двухфотонной микроскопии in vivo. Для визуализации морфологических изменений в нейронных структурах мы используем трансгенных мышей линии Thy1-GFP, у которых флуоресцентный белок GFP экспрессируется примерно в 10 процентах нейронов головного мозга.

Еще одним предлагаемым нами нововведением является инъекция AAV, экспрессирующего флуоресцентный белок mCherry под управлением нейрон-специфичного промотора, в глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, для визуализации проекций данной структуры в ретроспланиальную кору. Стерилизуйте все инструменты, стеклянные емкости для жидкостей и ватные тампоны в автоклаве. Используйте одноразовые перчатки.

Протрите операционный стол, стереотаксическую раму и всю прилегающую область 70% ethanol. Используйте стерильную хирургическую салфетку, чтобы создать стерильную зону для всего стерилизованного оборудования. Нарежьте гелевую губку на маленькие кусочки и замочите их в стерильном физиологическом растворе.

Поместите животное в индукционную камеру, установите уровень изофлурана на 5%, а поток кислорода — на два литра в минуту. Эта процедура должна занять около трех минут. Извлеките животное из индукционной камеры.

Для того чтобы убедиться в полной седации животного, используйте щипки за хвост или за пальцы лапы. С помощью прецизионного триммера выбрейте шерсть на затылке, между ушами, до уровня глаз. Поместите животное в стереотаксическую раму и зафиксируйте голову с помощью ушных фиксаторов.

Установите уровень анестезии на 1,5–2% изофлурана и подачу кислорода со скоростью 0,3 л/мин. Нанесите глазную мазь. Введите животному подкожно толфедина в дозе 4 мг/кг, бутомидора в дозе 2 мг/кг и Байтрил в дозе 5 мг/кг для предотвращения воспаления, боли и инфекции соответственно.

Введите животному внутримышечно дексаметазон в дозе 0,2 mg/kg для предотвращения отека головного мозга. Очистите кожу с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных бетадином, а затем 70% ethanol. Смените перчатки и обработайте их распылением 70% ethanol.

Приподнимите кожу пинцетом и с помощью микроножниц сделайте горизонтальный разрез кожи вдоль основания головы, а затем косой разрез до передней точки между глаз. Удалите кожный лоскут. Нанесите мазь лидокаина стерильным тампоном на надкостницу, чтобы предотвратить избыточное кровотечение и боль.

Используйте стерильные ватные тампоны или скальпель, чтобы удалить надкостницу. Просушите череп стерильными тампонами. С помощью стерильной иглы нанесите плотный цианоакрилатный клей на края кожи, чтобы иммобилизовать их и предотвратить дальнейший контакт с стоматологическим цементом.

Дождитесь высыхания клея. Положите стерильное покровное стекло толщиной 3 мм на череп передним краем к лямбдовидному шву. Центрируйте покровное стекло по ретросплениальным координатам: передне-заднее смещение относительно брегмы -2,8, медиально-латеральное смещение относительно брегмы 0.

Отметьте края покровного стекла, процарапав поверхность черепа стерильной иглой. Поместите покровное стекло обратно в стерильный контейнер с 70% этанолом. Используя высокоскоростную стоматологическую бормашину с бором малого диаметра, наметьте круг диаметром 3 мм.

Очистите место сверления от костной пыли стерильными тампонами, смоченными в физиологическом растворе. Для остановки периодического кровотечения и очистки кости используйте гелевую губку и тампоны. В перерывах между сверлением проверяйте толщину кости с помощью тонкого пинцета, осторожно касаясь костного кольца и проверяя его подвижность.

Учитывая, что кость в области швов более толстая, прекратите сверление, когда костный круг станет подвижным и по всей окружности останется только равномерный тонкий слой кости. Очистите операционное поле от остатков костной пыли с помощью тампонов, смоченных в физиологическом растворе.

Нанесите стерильный физиологический раствор на область сверления, покрывая просверленный круг. Осторожно подденьте костный диск тонким пинцетом, затем плавно, но уверенно извлеките его, поднимая вверх. Будьте осторожны и не перекашивайте костный диск при подъеме, чтобы избежать возможного повреждения твердой мозговой оболочки.

Осторожно приложите пропитанную стерильным физиологическим раствором гемостатическую губку к твердой мозговой оболочке, чтобы остановить кровотечение. Подождите до полного прекращения кровотечения. Осторожно удалите губку, чтобы не нарушить процесс свертывания крови.

Обратите внимание, что область наложения шва сильно васкуляризирована, поэтому кровотечение на данном этапе может быть обильным. Необходимо подождать достаточного времени до полной остановки кровотечения. Установите инфузионный насос на стереотаксическую стойку и подключите контроллер.

Вставьте иглу калибра 35 G в шприц для заполнения. Промойте шприц этанолом 10 раз для стерилизации и 10 раз стерильным физиологическим раствором для удаления остатков этанола. Удалите пузырьки воздуха из шприца.

Вставьте шприц в насос. Наберите одну дозу препарата AV и храните его на льду. Наполните шприц раствором вируса.

Центрируйте иглу относительно брегмы, а затем осторожно введите ее в гиппокамп, используя следующие координаты: передне-заднее направление -2, медиально-латеральное направление ±1, дорсо-вентральное направление -1. Эти координаты будут расположены близко к краю краниальной области. Подождите пять минут для стабилизации ткани.

Введите 0.7 µL раствора AV со скоростью 50 nL/min. Подождите 10 минут для полного поглощения вируса. Осторожно извлеките иглу.

При возникновении кровотечения промокните его гелевой губкой. Повторите процедуру с контрлатеральной стороной. Поместите стерильное сухое покровное стекло на поверхность твердой мозговой оболочки внутри области просверленного отверстия.

Удерживая покровное стекло пинцетом, осторожно расправьте твердую мозговую оболочку и прижмите края стекла к поверхности черепа. С помощью стерильной иглы нанесите плотный цианоакрилатный клей на края покровного стекла, чтобы зафиксировать его на черепе. Дождитесь высыхания клея.

Установите фиксирующую планку, гайку-антон или изделие собственной разработки в передней части черепа. Обратите внимание, что фиксирующая планка должна быть расположена таким образом, чтобы обеспечить горизонтальное положение краниального окна во время сеанса визуализации. Нанесите клей по краям планки.

Дождитесь высыхания клея. Обратите внимание, что фиксирующую планку следует располагать как можно дальше от окна. Если расположить её слишком близко к окну, планка и винт, соединяющий её со специально изготовленным держателем, могут стать препятствием для объектива в процессе получения изображений.

Приготовьте стоматологический акрил и нанесите его на поверхность черепа вокруг стекла. Рекомендуется сформировать вокруг окна углубление в виде кратера. Это создаст полость для воды, которая будет добавлена позже для проведения визуализации с использованием водяного объектива.

Сформируйте колпачок из стоматологического акрила, покрывая остальные края кожи операционного поля и фиксирующую планку, укрепляя края кратера вокруг краниального окна. Дождитесь затвердевания стоматологического цемента. Извлеките животное из стереотаксической рамы и поместите его в камеру для восстановления.

Дождитесь восстановления животного после операции, наблюдая за физиологическими функциями. В течение 48 часов применяйте послеоперационную анестезию циропроферрином в дозе 10 mg/kg и курс антибиотиков байтрилом в дозе 5 mg/kg. Включите титан-сапфировый лазер и подайте питание на микроскоп.

Система, используемая в данном эксперименте, оснащена двухфотонным лазером, системой OPO и двухканальными ФЭУ на основе арсенида галлия. Поместите животное в индукционную камеру для введения в состояние наркоза. Извлеките животное из индукционной камеры и поместите его под микроскоп в маску для газового наркоза.

Снизьте поток кислорода до 0,3 л/мин, а концентрацию изофлурана — до 1,52%. Зафиксируйте животное в специально изготовленной раме для микроскопа с помощью винта MT или другой аналогичной системы. Выровняйте краниальное окно. Обратите внимание, что можно использовать систему фиксации головы от производителя микроскопа, однако специализированная рама обеспечивает лучшие результаты, повышенную стабильность головы и постоянство позиционирования в течение нескольких сессий в ходе хронического эксперимента.

Используя настройки широкопольного микроскопа и объектив с малым увеличением, отцентруйте поле зрения на одной из сторон ретросплениальной коры и сфокусируйте его на поверхности покровного стекла. Нанесите каплю воды в акриловую лунку кратерообразной формы. Переключитесь на иммерсионный объектив для работы с водой с большим рабочим расстоянием.

Перемещайте объектив к краниальному окну до тех пор, пока мениск воды не соединит образец и объектив. Переключитесь на настройки двухфотонного режима и начните сканирование образца сверху вниз с минимальным увеличением. Пересечение твердой мозговой оболочки будет видно как блик высокого неспецифического сигнала.

Отрегулируйте настройки получения изображений на микроскопе для обоих каналов, GFP и mCherry, в соответствии с интенсивностью сигнала от флуоресцентных клеток, чтобы охватить весь динамический диапазон. Найдя подходящий нейрон, дендритное дерево которого отделено от других клеток, выполните первичный скан, используя только фильтры GFP при минимальном увеличении и Z-шаге 5 µm. Получите максимальную проекцию стека сканирования и распечатайте ее с инверсией цветов для внесения аннотаций.

Установите увеличение, позволяющее визуализировать необходимые морфологические детали. Сфотографируйте все дендритное дерево в каналах GFP и mCherry, используя максимальную проекцию в качестве ориентира. Данный протокол позволяет осуществлять повторный мониторинг как пре-, так и постсинаптических структур в ретросплениальной коре.

Данный подход может быть использован в хронических экспериментах, в которых поведенческие манипуляции, как ожидается, будут коррелировать с изменениями морфологии дендритов, синаптических шипиков или пресинаптических окончаний нейронов. Сеансы визуализации можно проводить с любой частотой, однако предпочтительным является 24-часовой интервал, чтобы обеспечить полноценное восстановление животного и минимизировать воздействие анестезии. При правильном применении этот метод позволяет проводить многократные сеансы визуализации на протяжении нескольких месяцев.