Радиоактивной и Количественная клеточном уровнях фосфоинозитидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании-Flow мерцаний

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить количество каждого вида фосфоинозитида в клетках при различных генетических условиях и условиях окружающей среды, чтобы понять функцию и регуляцию фосфоинозитида. Фосфоинозитидные липиды контролируют функции клеток, такие как миграция, репликация и транспортировка памяти. Этот метод выявляет генетические условия и условия окружающей среды, которые влияют на фосфоинозитиды, и расширяет наши знания об их регуляции и функции.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет точно одновременно измерять все фосфоинозитиды внутри клеток. Хотя этот метод может дать представление о регуляции фосфоинозитидов в дрожжах, он также может быть применен к культивируемым клеткам млекопитающих. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за множества этапов, необходимых для маркировки, обработки и анализа.

Мы рекомендуем сначала потренироваться без радиоактивной метки. Для начала вырастите 20 миллилитровую жидкую культуру штамма дрожжей SEY6210 в полной синтетической среде при температуре 30 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием до середины логарифмической фазы. Затем перенесите в общей сложности от 10 до 14 OD дрожжевых клеток в 12-миллилитровую центрифужную пробирку с круглым дном и центрифугируйте при 800-кратном G в течение пяти минут.

Сцедите среду. И повторно суспендируйте гранулу в 2 миллилитрах среды, не содержащей инозитола. Снова центрифугируйте ячейки.

А затем повторно суспендировать гранулу в 440 микролитрах среды, не содержащей инозитола. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации добавьте 60 микролитров трития, меченного мио-инозитолом, и выращивайте клетки еще один-три часа при температуре 30 градусов Цельсия при постоянном встряхивании.

Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 микролитров 9%-ной хлорной кислоты и 200 микролитров промытых кислотой стеклянных шариков. Перемешивайте, многократно переворачивая трубку, а затем выдерживайте на льду в течение пяти минут. После этого вращайте трубку на максимальной скорости в течение 10 минут.

Затем перенесите лизат в новую микроцентрифужную пробирку с помощью наконечника для загрузки геля, чтобы избежать аспирации стеклянных шариков. Далее центрифугируйте пробирку и выбросьте надосадочную жидкость. Обработайте гранулу ультразвуком в одном миллилитре ледяной 100 миллимолярной ЭДТА до полного рассеивания, и снова центрифугируйте.

После центрифугирования отсасывайте ЭДТА из пробирки, содержащей радиоактивную меченую гранулу. Добавьте 50 микролитров воды и ультразвуком для повторного суспендирования гранул. Приготовьте свежий реагент для деацилирования согласно текстовому протоколу.

Затем добавьте в пробирку 500 микролитров реагента для деацилирования, и перемешайте ультразвуком. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее перенесите образец в нагревательный блок при температуре 53 градуса Цельсия на 50 минут.

После этого поместите образец в вакуумную центрифугу и дайте ему высохнуть в течение как минимум трех часов. Повторно суспензируйте гранулу, обработав ультразвуком в 300 микролитрах воды, и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого полностью высушите образец в вакуумной центрифуге в течение как минимум трех часов.

После высыхания добавьте в тюбик 450 микролитров воды и повторно суспензируйте гранулу ультразвуком до полного распыления. Приготовьте свежий экстракционный реагент в соответствии с текстовым протоколом. Добавьте 300 микролитров экстракционного реагента и сделайте вихрь на максимальной скорости в течение пяти минут.

Центрифугируйте пробирку при 18000 умноженных на G в течение двух минут, и осторожно пипетируйте нижний водный слой в новую пробирку. Затем высушите конечную водную фракцию методом вакуумного центрифугирования в течение минимум трех часов. После этого полностью диспергируйте гранулу, обработав ультразвуком в 50 микролитрах воды, и храните образец при температуре 20 градусов Цельсия.

Наконец, определите радиоактивность образца, добавив от двух микролитров до четырех миллилитров сцинтилляционной жидкости в полиэтиленовый сцинтилляционный флакон объемом 6 миллилитров. Запишите CPM флакона с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика с открытым окном. Чтобы настроить систему ВЭЖХ для разделения глицероинозитидов, меченных тритием, сначала подготовьте буферы А и В, а также хроматографическую колонку в соответствии с текстовым протоколом.

Затем загрузите 10 миллионов CPM образца в двухмиллилитровый флакон для инъекций, оснащенный подпружиненным вкладышем объемом 250 микролитров, и добавьте воды в общем объеме 55 микролитров. Закройте флакон завинчивающейся крышкой, оснащенной силиконовой перегородкой из ПТФЭ, и поместите его в лоток для автоматического отбора проб системы ВЭЖХ вместе с заготовкой воды в аналогичном флаконе. Используя программное обеспечение на системе ВЭЖХ, запрограммируйте протокол элюирования.

Один процент буфера В на пять минут, от одного до 20 процентов В на сорок минут, от 20 до 100 процентов В на десять минут, 100% В на пять минут, от 100 до одного процента В на двадцать минут, а затем один процент В на десять минут. Установите расход насоса на уровне 1,0 миллилитров в минуту в течение 90 минут, а предел давления на уровне 400 бар. Затем настройте протокол обнаружения на сцинтилляторе потока на работу в течение 60 минут со скоростью потока сцинтилляционной жидкости 2,5 в минуту и временем выдержки 8,57 секунды.

Затем запрограммируйте автоматическую последовательность впрыска в ВЭЖХ, чтобы начать с заполнения воды, выполняющей протокол балансировки, за которым последует радиомаркированный образец по протоколу элюирования. Прежде чем протокол балансировки будет завершен, создайте последовательность партий на сцинтилляторе потока, чтобы измерить все образцы с помощью протокола обнаружения, который запускается протоколом элюирования. Чтобы проанализировать данные ВЭЖХ, сначала откройте файл исходных данных для каждого образца с помощью программного обеспечения для количественного определения хроматографа.

На вкладке хроматограммы увеличьте масштаб, чтобы растянуть меньшие пики, сохраняя при этом временное разрешение. Используйте инструмент добавления ROI, чтобы выделить каждый пик для анализа, а затем определите пики на основе времени их элюирования. Используйте вкладку таблицы регионов для поиска и записи площади каждого пика.

При этом отметьте время начала и окончания каждой вершины. Затем выполните фоновое вычитание для каждой вершины, выделив область, прилегающую к вершине, охватывающую то же количество времени. Используя программное обеспечение для работы с электронными таблицами, вычтите количество отсчетов для этой области из числа счетчиков соответствующего пика.

Нормализуйте площадь каждого пика по отношению к родительскому глицерированному пику инозитола и зарегистрируйте в процентах от родительского фосфатидилинозитола. Затем нормализуйте каждый из пиков в каждом экспериментальном условии по отношению к контрольному условию и выразите увеличение конечного сгиба по сравнению с контролем. Экспортируйте файлы, нажав «Файл» и «Сохранить как», и выберите формат CSV.

Наконец, откройте файл CSV в программе для работы с электронными таблицами, чтобы построить график данных. Анализ радиоактивно меченых фосфоинозитидов дрожжей проводили методом ВЭЖХ. Поскольку дрожжевые клетки генерируют только четыре фосфоинозитида, разрешение может быть достигнуто с помощью метода двойного градиентного элюирования за один час.

Пик глицерированного инозитола, достигавший от восьми до девяти минут, затмевал сигнал от всех других фосфорилированных веществ. Следовательно, перед интегрированием радиоактивных сигналов необходимо увеличить часть трассы, содержащую другие пики. Штаммы дрожжей дикого типа, ATG18 и VAC14 удалены на изменение фосфатидилинозитола 3, 5-бисфосфата с использованием этого метода ВЭЖХ.

Было показано, что удаленный мутант ATG18 продуцирует больше всего фосфатидилинозитола 3, 5-бисфосфата, а удаленный мутант VAC14 продуцирует меньше всего. После освоения этой техники ее можно сделать за четыре дня, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об оптимизации условий роста и мечения в зависимости от конкретного штамма дрожжей или типа клеток.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как биосенсоры с GFP-сплавом, чтобы дополнить сцинтилляцию потока ВЭЖХ для обнаружения фосфоинозитидов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как радиомаркировать, извлекать и измерять фосфоинозитиды с помощью сцинтилляции с сопряженным потоком ВЭЖХ. Не забывайте, что работа с радиоактивностью и органическими растворителями может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и соответствующая подготовка.