Фосфоресцентный проточной цитометрии с люминесцентные клеток штриховое кодирование для сигнализации биомаркер обнаружение и анализ отдельной ячейки

Здесь представлен протокол для анализа средне высокой производительностью событий фосфорилирование белков на клеточном уровне. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии и иммунологии, такие как, как сигнальные пути, затронутые различными стимулами или наркотиками? Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет выполнять анализ одноклеточной сигнализации в средней и высокой пропускной способности моды. После повторной приостановки клеток в дополнительной RPMI 16/40 среды, передать необходимое количество клеточной подвески в скважины 96 хорошо V-нижней пластины.

Перенесите тарелку на разогретую до 37 градусов по Цельсию водяную баню и дайте ей отдохнуть там в течение 10 минут. Затем добавьте 60 микролитров фиксированного буфера по одному к каждому колодец новой пластины 96 хорошо, чтобы настроить пластину исправления. Поместите эту тарелку в 37 градусов по Цельсию водяной бане.

Перенесите 50 микролитровый контрольный образец на тарелку и перемешайте с помощью трубок вверх и вниз. Дополнительно добавьте 10 микролитров на миллилитр анти-IgM в клетки, чтобы начать курс времени моделирования и перемешать, трубя вверх и вниз. Передача 50 микролитров образца на пластину исправления в каждой точке времени, смешивая каждый образец, как он добавляется.

После добавления последнего образца оставьте пластину в водяной бане на 10 минут. Во-первых, мыть клетки три раза с PBS. Центрифуга пластины на 500 раз G в течение пяти минут и отказаться от супернатанта.

Далее, подготовить свежие 96 хорошо V-нижней пластины с штрихкодирование реагентов, путем трубопроводов пять микролитров каждого штрихкодирования реагента в каждой скважине заполнения количество скважин, необходимых для окрашивания каждого из образцов. В фиксированной клеточной пластине, повторного перерасхода клеток в каждой хорошо с 190 микролитров PBS. Затем перенесите каждый колодец ячеек в соответствующий колодец в пластине штрихкодирования, тщательно смешивая каждый из них.

Пусть пластина отдыхает при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте. Центрифуга пластины на 500 раз G в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. После этого, мыть клетки в каждом хорошо в два раза с потоком мыть.

Затем добавьте 190 микролитров промывки потока в каждый колодец клеток. Объедините все штрих-коды в одну 15-миллилитровую трубку и перенесите каждый контроль компенсации в отдельную 1,7 миллилитровую трубку. Центрифуга на 500 раз G в течение пяти минут и отказаться от супернатанта.

Для начала перенесите два миллилитров пермского буфера три на 15 миллилитровую трубку. Хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию, так что это будет ледяной при использовании. Когда вы будете готовы, добавьте 1,5 миллилитров ледяного буфера завивки в 15 миллилитровую трубку, содержащую популяцию баркодируемых клеток, в то время как вихри, чтобы избежать слипания клеток.

Добавьте 100 микролитров буфера ледяной завивки к каждому из элементов управления компенсацией таким же образом. Немедленно перенесите клетки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение как минимум 30 минут. Когда готовы начать окрашивание антигена, удалить клетки из морозильной камеры и передать их в коробку со льдом.

Вымойте клетки три раза с избытком потока мыть. Центрифуга клеток в 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте популяцию баркодируемых клеток в объеме промывки потока, таким образом, что на пятно фосфо-антитела висят 25 микролитров клеточной суспензии.

Повторно приостановить контроль компенсации в 200 микролитров промывки потока. Чтобы начать готовить антитела для окрашивания, добавьте 10 микролитров фосфоспецифического антитела, разбавленного в потоке мытья, к каждому колодец свежей 96 хорошо V-нижней пластины. Добавьте 15 микролитров поверхностного маркера, разбавленных в потоке мытья и 25 микролитров клеточной подвески к каждой колодец для конечного объема 50 микролитров на колодец.

Пусть клетки отдыхают в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После этого, мыть окрашенные клетки в два раза с потоком мыть. Центрифуга при 500 раз G в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 150 микролитров промывки потока. Затем выполните анализ цитометрии потока, как указано в текстовом протоколе. В представленном протоколе трехмерное штрихкодирование выполняется путем объединения трех красителей штрихкодирования.

Индивидуальные образцы затем разъяснены путем последующего gating на каждом штрихкодирование реагента по сравнению с боковой области рассеяния. Базальные и стимуляции индуцированного фосфорилирования уровней 20 сигнальных молекул вниз по течению от рецептора В-клеток затем характеризуются в В-клеток от пациентов CLL и нормального контроля в различных условиях. Stat3 фосфо тирозин 705, как видно, значительно до регулируется.

Клетки стимулируются с анти-IgM на срок до 30 минут для того, чтобы определить сигнализации аберраций индуцированных через В-клеточных рецепторов пути. В то время как клетки CLL у пациентов с неизмененным IGVH отображают повышенную чувствительность к стимуляции анти-IgM, это только статистически значимо для AKT фосфора серина 473. Клетки затем подвергаются PI 3-киназы дельта ингибитор idelalisib для проверки, если аномальные AKT pS473 сигнал может быть отменен.

Как показано здесь, аномальные уровни значительно снижаются при лечении в зависимости от концентрации образом, демонстрируя, что ингибиторы киназы могут быть применены для нормализации аномальной сигнализации в клетках ХЛЛ. Перед попыткой этой процедуры важно помнить, чтобы титровать реагенты и антитела штрихкодирования, и проверить, что выбранные маркеры поверхности совместимы с фиксацией и реагентами пермялизации. Клетки должны быть в подвеске для анализа фосфора, по-прежнему протокол может быть адаптирован к аномальным клеткам или ткани следующие процедуры для получения одноклеточной суспензии, такие как вся трипсинация.