Получение и испытание импеданса на основе струйного биочипов с RTgill-W1 Клетки для быстрой оценки питьевой воды проб на токсичность

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как использовать биосенсор для оценки токсичности проб питьевой воды. Это достигается за счет создания биочипов, которые содержат монослой жаберных клеток радужной форели, а затем их использования в качестве части биосенсора, основанного на импедансе. Эта процедура позволяет быстро обнаруживать химическую токсичность в питьевой воде на уровнях, имеющих отношение к здоровью человека.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что биочипы можно использовать в полевых условиях, они могут храниться в холоде до девяти месяцев без какого-либо ухода или обслуживания клеток, а также в том, что они находятся в состоянии готовности к тестированию и могут быть использованы в любой момент после снятия с холодильника. Демонстрировать эту процедуру будет Джордан МакНэрн, студент бакалавриата нашей лаборатории. За день до посева клеток извлеките биочипы из упаковки и поместите их в стерилизованные пластиковые футляры для инструментов.

Присоедините к шприцу одну из трубок в сборе и наберите 20%-ный раствор отбеливателя в 20-миллилитровый шприц. Введите по два миллилитра раствора в каждый канал биочипа. Когда закончите, дайте биочипам постоять в течение одного часа с раствором отбеливателя.

Через час используйте стерильный одномиллилитровый шприц, оснащенный узлом Луэра с наружной резьбой, подключенным к вакуумной линии, чтобы отсасывать раствор отбеливателя из обоих каналов. После отсасывания отбеливателя из биочипа прикрепите к биочипу стерильную трубку в сборе с наружными скользящими люерами на каждом конце, чтобы использовать ее в качестве дренажа при промывке биочипов. Затем наберите стерильную воду в 20-миллилитровый шприц, и промойте каждый канал чипа пятью миллилитрами воды.

Вакуумируйте аспирацию воды, как и раньше. И поместите биочипы обратно в пластиковые корпуса для инструментов. Оставьте биочипы в биозащитном колпаке до следующего дня.

За час до посева биочипов введите два миллилитра раствора фибронектина с концентрацией 10 микрограммов на миллилитр в каждый канал биочипа. Инкубируйте биочипы в биозащитном колпаке в течение 60 минут, а затем вакуумируйте аспирацию раствора фибронектина. Наконец, поместите две стерильные трубки для биочипов на порты биочипов и отложите биочипы в сторону до тех пор, пока клетки не будут готовы к посеву.

Извлеките из инкубатора одну сливающуюся колбу Т-175, содержащую жаберные эпителиальные клетки радужной форели, и поместите ее в колпак биобезопасности. Одна конфлюирующая колба Т-175 сможет засеять примерно 16 биочипов. Отсасывайте среду из клеток.

Промойте их PBS и отасуньте PBS. А затем добавить в клеточный слой шесть миллилитров раствора Трипсин-ЭДТА. Выдерживайте колбу при комнатной температуре около пяти минут.

Затем добавьте 15 миллилитров полной среды для клеточных культур L-15 в каждую колбу, чтобы деактивировать трипсин. Возьмите небольшую аликвоту из клеточной суспензии и с помощью гемоцитометра измерьте концентрацию клеток. Рассматривайте клетки с помощью светлопольного микроскопа, оснащенного 10-кратным объективом.

Затем рассчитайте текущую концентрацию клеток и отрегулируйте клеточную суспензию до концентрации четверти миллиона клеток на миллилитр. Далее с помощью стерильного шприца объемом 20 миллилитров введите по 2,5 миллилитра клеточной суспензии во внешний порт каждого канала биочипа. Дайте суспензии с дополнительными ячейками вытечь из трубки в контейнер для отходов.

Затем создайте замкнутый контур для каждого канала биочипа, вставив свободный конец шланга с фитингом Люэра во внешний порт для каждого канала. Затем смочите бумажное полотенце с 70% этанолом и используйте его, чтобы стереть излишки среды с замкнутых контуров. Затем поместите биочипы обратно в пластиковую коробку.

На четвертый и седьмой день извлеките биочипы из инкубатора. И замените среду в биочипах на сбалансированную по температуре полную среду для клеточных культур L-15. После седьмого дня кормления снимите и откиньте шланги от чипов и вставьте сливные пробки автоклава в биочипы.

Поместите биочипы в коробку в инкубаторе с температурой шести градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы для тестирования. Извлеките тестовый считыватель ECIS и расходные материалы из чехла для переноски, а затем включите считыватель. Также достаньте один из подготовленных биочипов из шестиградусного инкубатора и поместите его на бумажное полотенце.

С помощью шприца объемом 10 миллилитров налейте 10 миллилитров контрольной воды в прозрачную пластиковую банку объемом 0,5 унции. Обязательно удалите пузырьки для точного измерения. Затем используйте отдельный шприц и налейте 10 миллилитров тестового образца в прозрачную пластиковую банку объемом 0,5 унции.

Далее извлеките два порошкообразных флакона со средой. Откройте один из порошкообразных пробирок и вылейте все содержимое одного флакона в банку с контрольной водой, опустив весь флакон в раствор. Повторите эту процедуру с тестовой банкой.

Затем закупорьте и встряхните банки, чтобы убедиться, что порошок полностью растворился. Наполните синий шприц объемом 10 миллилитров девятью миллилитрами контрольного раствора. И красный 10-миллилитровый шприц с девятью миллилитрами тестового раствора из соответствующих флаконов.

Удалите из шприцев все имеющиеся пузырьки воздуха. Далее снимаем заглушки с портов биочипа и прикрепляем слив. Поместите биочип в съемный пластиковый лоток в считывателе ECIS, закройте крышку, а затем прикрепите заполненные шприцы к внешним портам биочипа.

Наконец, прикрепите поршни шприца. На главном экране устройства чтения нажмите кнопку Далее, чтобы начать предварительный тест. Затем программное обеспечение проверит начальные импедансы.

Если импедансы находятся в пределах допустимого диапазона, на экране появится сообщение «Картридж пройден» и пользователю будет предложено выбрать «Далее». Затем введите сведения о образце с помощью виртуальной клавиатуры, а затем нажмите кнопку Принять, когда закончите. На этом этапе данные о импедансе будут собраны за две минуты со вставленного биочипа, а экранный таймер будет отсчитывать время.

Через две минуты нажмите кнопку «Далее». Когда мигающим зеленым прямоугольником будет предложено ввести образцы сейчас, введите контрольную и тестовую среду из подключенных шприцев одновременно в каналы биочипа. По окончании оставьте шприцы на месте на биочипах.

Если программное обеспечение считывателя ECIS определит, что канал обработки статистически отличается от контрольного канала в любой момент испытания, на экране появится указание на то, что образец загрязнен. В противном случае это будет означать, что в конце периода мониторинга загрязнение не обнаружено. Запишите результаты теста как «Загрязненные» или «Не загрязненные» для каждого образца.

По окончании тестового прогона извлеките и выбросьте биочип. Промойте и высушите на воздухе шприцы, тестовые флаконы и съемный пластиковый лоток, в котором размещался биочип во время испытаний. 13 химических веществ, представленных на снимке, были отобраны для тестирования в качестве представителей широкого спектра токсичных промышленных соединений, которые могут быть возможными загрязнителями питьевой воды.

Во время тестирования девять из 13 были обнаружены с помощью измерения импеданса подложки электрического элемента в течение часа в концентрациях, которые имеют отношение к здоровью человека. Здесь показаны типичные выходы, которые можно увидеть после испытания на измерение импеданса подложки электрической ячейки. Загрязненные образцы в конечном итоге имеют значительно более низкие уровни импеданса по сравнению с контрольными пробами чистой воды.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как получить биочип с монослоем жаберных эпителиальных клеток радужной форели и впоследствии использовать этот биочип в тесте на токсичность на основе импеданса для оценки токсичности питьевой воды. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об асептической работе при подготовке биочипов, а также хранить биочипы в холодильнике до тех пор, пока они не будут использованы. Каждый биочип может быть использован только один раз, а затем должен быть утилизирован.

После освоения биочипа подготовка может быть выполнена примерно за 10 минут. Это оценка, потому что чипсы готовятся партиями. Испытание импеданса образца, включая подготовку образца, занимает около одного часа 10 минут, если оно выполнено правильно.

После этой процедуры другие методы, такие как аналитическая химия, могут быть применены к образцу, который дал загрязненный результат, чтобы идентифицировать подозреваемое химическое вещество или химические вещества. Разработка этого метода открывает путь для исследователей, заинтересованных в определении токсичности воды, к использованию технологии с использованием эпителиальных эпителиальных клеток радужной форели и импедансного зондирования. Мы надеемся, что вы найдете эти методы полезными, и с нетерпением ждем будущих инноваций, которые эти новые возможности могут помочь облегчить.

Спасибо и хорошего дня.