Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы оптически сообщать об изменениях потенциала мембраны с помощью генетически закодированного индикатора напряжения. В этом методе будут описаны сильные и слабые стороны визуализации с помощью различных генетически кодируемых флуоресцентных зондов напряжения. Например, преобразователи на основе FRET будут иметь преимущество ратиометрической визуализации, но будут давать более низкий сигнал.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем визуализировать нейронную активность в режиме реального времени. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что отношение сигнал/шум не очень велико, и есть несколько источников шума и множество шагов, которые могут пойти не так. Новые пользователи часто путаются, и помехи принимаются за реальные сигналы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для установления достоверности используемых зондов и того, что они на самом деле указывают. Для настройки между медленными и быстрыми ПЗС-камерами устанавливается разделитель изображения для получения изображений GEVI на основе FRET. Перед экспериментом вставьте в разделитель изображения фильтрующий куб с дихроичным зеркалом и двумя эмиссионными фильтрами.

Удалите этот второй фильтрующий куб при визуализации GEVI с одним флуоресцентным белком. Чтобы начать эксперимент, найдите здоровую клетку HEK293, которая демонстрирует сильную, локализованную флуоресценцию мембраны по сравнению с внутренней флуоресценцией, и избегайте заплатки кольцевых клеток, когда они либо делятся, либо умирают. Затем подайте тестовый импульс для проверки текущей реакции.

После этого опустите дозатор с патч-зажимом прямо над поверхностью клетки. Затем медленно опустите пипетку до тех пор, пока она не коснется клеточной мембраны. Сопротивление мембраны должно увеличиться до одного-двух мегаом.

После этого установите гигаомное уплотнение, осторожно оказывая отрицательное давление через пипетку. Как только гигаомное уплотнение будет достигнуто, установите потенциал пипетки на желаемый потенциал удержания. Далее сфокусируйте высокоскоростную ПЗС-камеру на корпусе клетки.

Для записи GEVI на основе FRET отрегулируйте размер разделенных изображений, чтобы получить равномерное изображение для каждой длины волны излучения с помощью ручек на разделителе изображений. Затем разорвите клеточную мембрану, оказывая отрицательное давление, чтобы сформировать всю конфигурацию клетки. Теперь откройте программное обеспечение для работы с изображениями.

Затем нажмите кнопку Захватить камеру SciMeasure, чтобы открыть страницу получения ПЗС-матрицы. Далее создайте новый файл данных для сохранения записи. Нажмите кнопку «Аналоговый выход», а затем считайте ASCII, чтобы открыть файл протокола импульсов для проведения визуализации.

Далее кликаем по среднему количеству внутренних повторений, чтобы усреднить количество попыток. Затем закройте страницу аналогового вывода. Задайте конкретные параметры сбора данных на странице получения CCD.

После этого введите конкретные значения для количества кадров для получения и количества попыток. Затем нажмите кнопку Take Data optics plus BNC, чтобы начать запись. Во время получения изображения напряжения следите за осциллографом, чтобы обеспечить стабильную конфигурацию всего элемента на протяжении всей записи.

Чтобы рассчитать изменение дробной флуоресценции, щелкните файл, а затем прочтите файл данных, чтобы открыть файл данных, который был записан на предыдущем шаге. Изображение клетки в ее освещенности в состоянии покоя должно быть видно с правой стороны. Затем нажмите на «Показать BNC», чтобы показать текущие значения конечного напряжения.

Измените режим страницы с RLI на вычитание кадра, чтобы использовать функцию вычитания кадров для идентификации пикселей с помощью реагирующих оптических сигналов. Затем выберите две временные точки для вычитания и определите область клетки, которая показывает сигналы в ответ на изменение потенциала мембраны. Затем обозначьте пиксели, которые необходимо проанализировать, перетащив или щелкнув каждый пиксель.

Графическое представление средней интенсивности флуоресценции по выбранным пикселям должно появиться в левой части окна программы. Разделите вычитаемые пиксели с интенсивностью света покоя, нажав кнопку «Разделить» на RLI, чтобы получить значения изменения дробной флуоресценции. Чтобы экспортировать данные, удалите графики текущего конечного напряжения, сняв нажатие кнопки «Показать меню BNC».

Перейдите к выводу, сохраните трассы как отображаемые ASCII, чтобы экспортировать флуоресцентную кривую в формат файла ASCII для анализа аппроксимации кривой. В этой процедуре мы построим график зависимости изменения флуоресценции от напряжения путем построения графика дробных изменений флуоресценции в зависимости от напряжения в программе анализа данных. После этого подгоните кривую к функции Больцмана, чтобы определить диапазон напряжения оптического сигнала путем щелчка анализа, подгонки, сигмоидальной подгонки, затем откройте диалоговое окно.

Перестройте график нормализованных изменений дробной флуоресценции в ответ на напряжение с помощью программы анализа данных. Чтобы рассчитать скорость оптического отклика, откройте файл ASCII и постройте график зависимости кривой изменения фракционной флуоресценции от времени. Затем нажмите на селектор данных в программном обеспечении для анализа данных и выберите одну временную точку, соответствующую началу ступенчатого импульса напряжения, и вторую временную точку, где оптический сигнал достиг устойчивого состояния.

Подгоните этот диапазон как к одинарной, так и к двойной функции экспоненциального затухания, щелкнув по анализу, аппроксимации, экспоненциальной аппроксимации, затем откройте диалоговое окно и сообщите о лучшей аппроксимации. На этом рисунке показано изменение флуоресценции HEK-клетки, экспрессирующей одну молекулу GEVI Bongwoori на основе FP. Это типичное изменение флуоресценции в ответ на ступенчатые импульсы напряжения.

Здесь ячейка HEK293 была сфотографирована с помощью высокоскоростной ПЗС-камеры. На этом изображении показана интенсивность света в состоянии покоя клетки, экспрессирующей Бонгури. А это изображение с вычитанием кадра с указанием пикселей, в которых наблюдалось изменение флуоресценции.

Здесь показана оптическая запись потенциалов индуцированного действия от первичных нейронов гиппокампа мыши, экспрессирующих Бонгури. Потенциалы действия вызывались в режиме зажима токов всей ячейки. Траектория изменения фракционной флуоресценции была выбрана из пикселей, коррелированных с сомой.

На этом рисунке изменение флуоресценции ячейки HEK, экспрессирующей GEVI на основе FRET, показывает реакцию на ступенчатые импульсы напряжения в двух длинах волн. Записывается с частотой в один килогерц с помощью высокоскоростной ПЗС-камеры. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тестировании переменных уровней флуоресценции, так как чрезмерная экспрессия флуоресценции может повлиять на здоровье клетки.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как кодирование среза, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с нейронной активностью различных цепей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать мембранный потенциал с помощью различных типов преобразователей.