Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения
4 февраля 2016 г.
Описан метод визуализации изменений мембранного потенциала с использованием генетически закодированных индикаторов напряжения.
Общая цель данной процедуры заключается в оптической регистрации изменений мембранного потенциала с помощью генетически кодируемого индикатора напряжения. В этом методе будут описаны преимущества и недостатки визуализации с использованием различных генетически кодируемых флуоресцентных зондов напряжения. Например, зонды на основе FRET обладают преимуществом ратиометрической визуализации, но обеспечивают более слабый сигнал.
Основным преимуществом данного метода является возможность визуализации нейронной активности в режиме реального времени. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку отношение сигнал-шум не слишком велико, существует несколько источников помех и множество этапов, на которых могут возникнуть ошибки. Новички часто путаются, принимая интерференцию за реальные сигналы.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для подтверждения валидности используемых зондов и того, что именно они показывают. Для настройки установки между медленной и быстрой CCD-камерами устанавливается разделитель изображения для визуализации GEVI на основе FRET. Перед началом эксперимента вставьте в разделитель изображения фильтр-куб с дихроичным зеркалом и двумя эмиссионными фильтрами.
Удалите этот второй фильтр-куб при визуализации GEVI с одним флуоресцентным белком. Для начала эксперимента найдите здоровую клетку HEK293, которая демонстрирует сильную локализованную мембранную флуоресценцию по сравнению с внутренней флуоресценцией; избегайте патчинга округлых клеток, так как они либо делятся, либо погибают. Затем подайте тестовый импульс для проверки токового отклика.
После этого опустите пипетку для патч-клампа непосредственно над поверхностью клетки. Затем медленно опускайте пипетку до тех пор, пока она осторожно не коснется клеточной мембраны. Сопротивление мембраны должно увеличиться до одного-двух МОм.
После этого создайте гигаомный seal, осторожно приложив отрицательное давление через пипетку. После достижения гигаомного seal установите потенциал пипетки на необходимый удерживающий потенциал. Затем сфокусируйте высокоскоростную CCD-камеру на теле клетки.
Для регистрации GEVI на основе FRET отрегулируйте размер разделенных изображений с помощью ручек разделителя изображений, чтобы обеспечить равномерное отображение для каждой длины волны излучения. Затем разорвите клеточную мембрану, приложив отрицательное давление, чтобы сформировать конфигурацию целой клетки. Теперь откройте программное обеспечение для визуализации.
Затем в меню камеры SciMeasure нажмите acquire, чтобы открыть страницу захвата изображения ПЗС. Далее создайте новый файл данных для сохранения записи. Нажмите analog output, а затем read an ASCII, чтобы открыть файл протокола импульсов для проведения визуализации.
Затем нажмите «average the internal repetitions», чтобы усреднить количество испытаний. После этого закройте страницу аналогового выхода. Установите конкретные параметры сбора данных на странице CCD acquire.
После этого введите конкретные значения количества кадров для сбора данных и количества попыток. Затем нажмите кнопку «take data optics plus BNC», чтобы начать запись. Во время проведения вольтажной визуализации следите за осциллографом, чтобы убедиться в стабильности конфигурации целого कोशिकाओं на протяжении всей записи.
Чтобы рассчитать относительное изменение флуоресценции, нажмите «file», а затем «read data file», чтобы открыть файл данных, записанный на предыдущем этапе. Справа должно появиться изображение клетки при исходной интенсивности света. Затем нажмите «show BNC's», чтобы отобразить текущие значения конечного напряжения.
Переключите режим страницы с кадра RLI на вычитание кадров, чтобы использовать функцию вычитания кадров для идентификации пикселей с соответствующими оптическими сигналами. Затем выберите две временные точки для вычитания и определите область клеток, которая демонстрирует сигналы в ответ на изменение мембранного потенциала. После этого выделите пиксели, которые необходимо проанализировать, перетаскивая курсор или щелкая по каждому пикселю.
Графическое представление средней интенсивности флуоресценции выбранных пикселей должно отобразиться в левой части окна программы. Для получения значений относительного изменения флуоресценции разделите значения вычтенных пикселей на интенсивность покоящегося света, нажав кнопку divide by RLI. Для экспорта данных удалите текущие графики конечного напряжения, сняв флажок в меню show BNC.
Перейдите в раздел «output» (вывод) и сохраните трейсы в формате «displayed ASCII», чтобы экспортировать кривую флуоресценции в ASCII-файл для последующего анализа аппроксимации. В ходе данной процедуры постройте график изменения флуоресценции в зависимости от напряжения, отобразив относительные изменения флуоресценции в ответ на изменение напряжения в программе для анализа данных. После этого, чтобы определить диапазон напряжений оптического сигнала, выполните аппроксимацию кривой функцией Больцмана, выбрав «analysis» (анализ), «fitting» (аппроксимация), «sigmoidal fit» (сигмоидальная аппроксимация) и затем «open dialog» (открыть диалоговое окно).
Постройте заново график нормализованных относительных изменений флуоресценции в ответ на напряжение, используя программу для анализа данных. Чтобы рассчитать скорость оптического отклика, откройте ASCII-файл и постройте график зависимости кривой относительного изменения флуоресценции от времени. Затем нажмите на селектор данных в программном обеспечении для анализа данных и выберите одну временную точку, соответствующую началу ступенчатого импульса напряжения, и вторую временную точку, в которой оптический сигнал достиг стационарного состояния.
Подберите этот диапазон как к функции одноэкспоненциального, так и к функции двухэкспоненциального затухания, нажав analysis, fitting, exponential fit, затем open dialog, и определите, какая аппроксимация является более точной. На этом рисунке показано изменение флуоресценции клетки HEK, экспрессирующей один FP-основанный GEVI Bongwoori. Это типичное изменение флуоресценции в ответ на ступенчатые импульсы напряжения.
Здесь представлена клетка HEK293, зафиксированная с помощью высокоскоростной CCD-камеры. На этом изображении показана интенсивность покоящегося света в клетке, экспрессирующей Bongwoori. А это изображение с вычитанием кадров, указывающее на пиксели, в которых наблюдалось изменение флуоресценции.
Здесь представлена оптическая запись индуцированных потенциалов действия первичных нейронов гиппокампа мыши, экспрессирующих Bongwoori. Потенциалы действия вызывались в режиме фиксации тока всей клетки (whole-cell current clamp). Кривая относительного изменения флуоресценции была получена на основе пикселей, соответствующих соме.
На данном рисунке показано изменение флуоресценции клетки HEK, экспрессирующей GEVI на основе FRET, в ответ на ступенчатые импульсы напряжения на двух длинах волн. Запись проводилась с частотой 1 кГц с помощью высокоскоростной CCD-камеры. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тестирования различных уровней флуоресценции, так как гиперэкспрессия флуоресцентного белка может отрицательно сказаться на жизнеспособности клетки.
После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как кодирование срезов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся активности нейронов различных цепей. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как визуализировать мембранный потенциал с использованием различных типов зондов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод визуализации изменений мембранного потенциала с использованием генетически кодируемых индикаторов напряжения. Эта методика позволяет в реальном времени визуализировать нейронную активность, хотя и представляет определенные сложности для новых пользователей из-за уровня шума и проблем с интерпретацией сигнала.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Электрофизиология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Генетически кодируемые индикаторы напряжения используются для мониторинга изменений мембранного потенциала.
- Различные флуоресцентные зонды обладают своими преимуществами и недостатками.
- Зонды на основе FRET позволяют проводить рациометрическую визуализацию, но могут давать более слабый сигнал.
- Понимание соотношения сигнал/шум имеет решающее значение для точной интерпретации данных.
Цель исследования
- Для оптической регистрации изменений мембранного потенциала.
- Для оценки эффективности различных генетически кодируемых флуоресцентных зондов.
- Для получения данных о визуализации нейронной активности в режиме реального времени.
Используемые методы
- Использование генетически кодируемых индикаторов напряжения.
- Сравнение различных методов визуализации.
- Анализ отношения сигнал/шум.
- Оценка трудностей, с которыми сталкивается пользователь при интерпретации сигналов.
Основные результаты
- Возможна визуализация нейронной активности в режиме реального времени.
- Зонды на основе FRET обладают рядом преимуществ, несмотря на более слабые сигналы.
- Новые пользователи сталкиваются с трудностями из-за шумовых помех.
- Надлежащее обучение необходимо для того, чтобы отличать реальные сигналы от шума.
Выводы
- Генетически кодируемые индикаторы напряжения представляют большую ценность для нейробиологических исследований.
- Критически важно понимать ограничения различных зондов.
- Обучение и опыт могут улучшить интерпретацию сигналов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Визуализация мембранного потенциала с помощью генетически кодируемых индикаторов напряжения (GEVI) позволяет в реальном времени наблюдать за электрофизиологией клеток, что способствует валидации мишеней на ранних этапах разработки нейробиологических препаратов. Данный метод обеспечивает количественное динамическое считывание активности нейронов, помогая снизить механистические риски за счет установления связи между действием соединения и функциональными изменениями мембранного потенциала. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений, предоставляя данные прямого оптического мониторинга взаимодействия с мишенью в живых клетках.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем оптической регистрации динамики мембранного потенциала в ответ на фармакологическую модуляцию.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством прямого измерения изменений напряжения в режиме реального времени в живых клетках, экспрессирующих GEVIs.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в связывании с мишенью за счет получения рациометрических или основанных на интенсивности данных флуоресценции, коррелирующих со сдвигами напряжения.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: облегчает подготовку валидированных клеточных систем (например, HEK293) для последующего скрининга соединений посредством стабильной экспрессии GEVI и интеграции метода локальной фиксации мембраны (whole-cell patch clamp).
- Количественные данные: обеспечивает рациометрическую визуализацию с помощью GEVIs на основе FRET, что повышает надежность сигнала и снижает количество артефактов, вызванных вариабельностью экспрессии или фотообесцвечиванием.
- Масштабируемость: совместимость с высокоскоростным сбором данных с помощью ПЗС-матриц и автоматизированными протоколами подачи импульсов позволяет проводить повторные испытания и анализ зависимости «доза-эффект».
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Применимо к нейрональным моделям (например, первичным нейронам гиппокампа) для оценки воздействия соединений в электрофизиологическом контексте, релевантном конкретным заболеваниям.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает связь между результатами in vitro и потенциалом in vivo, устанавливая компетенцию в области визуализации отдельных клеток как необходимое условие для исследований сложных тканей.
- Снижение механистических рисков: Позволяет дифференцировать специфические для соединения вольтажные эффекты от неспецифического шума с помощью вычитания кадров и нормализации базовой линии.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска новых лекарственных средств — от первоначального анализа мишеней до оптимизации ведущих соединений, при этом функциональные показатели напряжения позволяют проводить отбор соединений перед доклиническими испытаниями эффективности.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем корреляции оптических сигналов со стимулами при фиксации потенциала (voltage-clamp) для подтверждения отклика зонда и жизнеспособности клеток.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые измерения, готовые для анализа, за счет стандартизированной конфигурации целого कोशिकाओं (whole-cell) и нормализации базовой флуоресценции.
- Аналитика: предоставляет данные о фракционном изменении флуоресценции и кинетический анализ (экспоненциальная аппроксимация) для количественной оценки амплитуды сигнала и скорости отклика.
- Трансляционные исследования: позволяет перейти от моделей на единичных клетках HEK293 к первичным нейронам, что способствует оценке трансляционной значимости.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу визуализации для исследований модуляции ионных каналов для различных классов мишеней и кампаний по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая прямой оптический мониторинг изменений мембранного потенциала в режиме реального времени в качестве функционального биомаркера нейрональной активности.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации за счет использования определенных протоколов патч-клампа, калибровки разделителя изображений и стандартизированных этапов анализа (вычитание кадров, нормализация RLI).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления побочных электрофизиологических эффектов, что снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем количественной оценки вызванных соединениями сдвигов напряжения с определенными порогами для перехода на следующий этап.
Особенности реализации
- Требуется экспертный опыт в области электрофизиологии (метод локальной фиксации мембраны в конфигурации whole-cell), флуоресцентной микроскопии и работы с GEVI.
- Работа зависит от наличия высокоскоростных ПЗС-камер, разделителей изображения и фильтр-кубов для двухволновой FRET-детекции.
- Необходима межкомандная стандартизация между специалистами по визуализации и электрофизиологии для обеспечения согласованного сбора данных.
- При адаптации метода следует учитывать тип GEVI (с одним FP или на основе FRET), уровни экспрессии и пригодность клеточной линии (например, следует избегать делящихся или погибающих клеток HEK293).
- Практические ограничения включают низкое соотношение сигнал/шум, подверженность артефактам при гиперэкспрессии и зависимость интерпретации оптических сигналов в сравнении с шумом от опыта пользователя.
