Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Общая цель данного хирургического метода заключается в получении аутологичных микротрансплантатов кожи, готовых к немедленному использованию в ходе той же операции для заживления ран. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины и тканевой инженерии кожи, касающиеся таких проблем, как заживление хронических ран, ожогов и посттравматических язв. Основным преимуществом этой методики является ее простота в применении врачами, не обладающими специальной технической подготовкой, а также ее быстрота и доступность.

Для начала с помощью панча для биопсии возьмите образцы кожи пациента. Затем удалите и утилизируйте эпителиальный слой. Смешайте каждый образец ткани с 1 milliliter физиологического раствора для получения аутологичных микротрансплантатов.

Для подготовки биокомплексов к клиническому применению перенесите 1 milliliter раствора микротрансплантата на коллагеновые губки. Немедленно нанесите биокомплекс на поврежденный участок пациента. Для проведения исследований in vitro проверьте жизнеспособность биокомплекса.

После трех дней культивирования залейте биокомплексы 0,3% формалином и фиксируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. С помощью микротома сделайте срезы толщиной 5 micrometers и нанесите их непосредственно на предметное стекло. Затем поместите срезы в 15–20 milliliters ксилола на три минуты.

Затем погрузите срезы в серию растворов этанола с убывающей концентрацией на один час в каждом, после чего поместите их в деионизированную воду для депарафинизации и регидратации срезов. Затем используйте от 1 до 2 мл гематоксилина в концентрации 1 г/л в течение одной-двух минут для окрашивания срезов. После этого перенесите их в воду, чтобы смыть краситель.

Затем окрасьте срезы в течение четырех-пяти минут, используя от 1 до 2 миллилитров 1% раствора эозина Y в 70% этаноле, разведенного в воде. После этого промойте стекла под проточной водой. Погрузите срезы в растворы этанола возрастающей концентрации на один час в каждом, после чего проведите часовую инкубацию в ксилоле.

Наконец, нанесите на образцы закрепляющую среду на основе смолы перед тем, как накрыть их покровным стеклом. Затем исследуйте их под световым микроскопом с 100-кратным увеличением. С помощью дерматома возьмите образцы сосочкового слоя, ороговевшего эпителия или дермы толщиной 0,6 мм, 1 мм или 0,2 мм соответственно из областей туловища четырех многотканевых доноров в возрасте от 40 до 55 лет в соответствии с национальными правилами забора биоматериала.

Поместите образцы в 0,9% NaCl и установите на орбитальный шейкер на пять минут для осторожного промывания ткани. С помощью биопсийного панча диаметром 5 мм вырежьте из кожной ткани (эпидермиса и дермы) образцы одинакового диаметра и взвесьте все фрагменты ткани. Затем поместите в дезинтегратор тканей восемь, три или четыре однородных образца кожи (эпидермиса или дермы соответственно) и добавьте 1,5 мл физиологического раствора для дезагрегации.

Выполните дезагрегацию для всех образцов ткани, как указано в данной таблице. В качестве контролей используйте соответствующее количество панч-биоптатов, полученных из интактных образцов ткани. После механической дезагрегации аспирируйте физиологический раствор, содержащий микрографты, и поместите каждый образец отдельно в одну лунку 12-луночного планшета.

Добавьте по 1 мл среды RPMI-1640, дополненной 10% FBS и антибиотиками, в каждый образец. Для оценки жизнеспособности клеток в каждую лунку добавьте 1 мл среды, содержащей 0,5 мг/мл раствора MTT, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение трех часов. После инкубации удалите среду с MTT и замените ее 1 мл DMSO.

После инкубации в течение 10 минут перенесите каждый образец в DMSO в кювету и с помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность при 570 нанометрах. Рассчитайте жизнеспособность клеток как отношение абсорбции при 570 нанометрах к весу ткани в граммах, использованному до дезагрегации. Затем, после аспирации физиологического раствора из тканей кожи, образцы эпидермиса и дермы от одного донора поместите по отдельности либо в лунку 12-луночного планшета для теста на жизнеспособность клеток, либо в культуральный флакон для морфологического анализа.

Добавьте 1 мл среды RPMI-1640 с 10% FBS и антибиотиками в 12-луночный планшет или 5 мл в культуральный флакон и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов или семи дней соответственно. Через 24 часа проведите морфологический анализ с помощью световой микроскопии, оценивая наличие клеточной суспензии. Повторите процедуру на седьмой день.

С помощью FACS-анализа исследуйте образцы дермы на наличие маркеров мезенхимальных и гемопоэтических клеток, таких как CD146, CD34 и CD45. Добавьте среду к дезагрегированным клеткам, затем инкубируйте при 37-degree Celsius в течение трех дней. Оцените стерильность ткани, проведя микробиологический анализ, как было описано ранее.

Как показано здесь, человеческие аутологичные микротрансплантаты, немедленно помещенные на коллагеновую подложку, были имплантированы в область повреждения ноги. Через 30 дней наблюдалась полная реэпителизация, сопровождавшаяся восстановлением тканей. Более того, клиническое наблюдение через пять месяцев показало хорошее качество текстуры и мягкость поврежденного участка.

Как указано в данной таблице, были установлены пороговые значения в восемь, четыре и три биопсии, которые могут быть обработаны за один этап, а ткани подвергались диссоциации в четыре разных временных интервала для определения оптимальных условий диссоциации с целью сохранения высокой жизнеспособности клеток. Механическая диссоциация, продемонстрированная в данном видео, обеспечивает средний уровень жизнеспособности клеток 30% во всех образцах кожи, включая эпидермис и дерму, при оценке в разные моменты времени относительно целой ткани. Этот график показывает, что через 24 часа или семь дней культивирования не наблюдалось существенных изменений жизнеспособности клеток в образцах тканей кожи к моменту гомогенизации в культуре по сравнению с начальным временем.

Однако через 24 часа культивирования наблюдалось снижение жизнеспособности погибших образцов по сравнению с начальным моментом времени. Тем не менее спустя семь дней культивирования жизнеспособность клеток восстановилась. Аналогичные результаты наблюдались и для дермы.

При должном навыке и правильном выполнении эта техника занимает пять минут. При проведении данной процедуры важно не забыть удалить эпителиальный слой кожи. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как дезагрегация костной ткани, чтобы ответить на другие вопросы, например, о механизмах заживления кости.

После своей разработки эта методика открыла исследователям в области регенеративной медицины и тканевой инженерии возможность изучать заживление тканей у пациентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как выполнять данную процедуру микротрансплантации. Не забывайте, что работа с тканями может быть крайне опасной.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков.