Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Общая цель этого хирургического изобретения заключается в получении аутологичных микротрансплантатов кожи, готовых к немедленному использованию в той же операции для заживления ран. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины и тканевой инженерии кожи о таких вещах, как заживление хронических ран, ожоги и посттравматические язвы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она очень проста в использовании врачом без экскаркицильной техники, а также является быстрой и доступной.

Для начала используйте биопсийный перфоратор для сбора образцов кожи пациента. Затем удалите и выбросьте эпителиальный слой. Соедините каждый образец ткани с 1 миллилитром физиологического раствора для получения аутологичных микротрансплантатов.

Чтобы приготовить биокомплексы для клинического применения, перенесите 1 миллилитр раствора микрографта на коллагеновые губки. Немедленно нанесите биокомплекс на травмированный участок пациента. Чтобы in vitro проверить жизнеспособность биокомплекса.

После трех дней культивирования влить 0,3%-ный формалин непосредственно на биокомплексы и зафиксировать в течение 10 минут при комнатной температуре. С помощью микротома нарежьте секции толщиной 5 микрометров и установите прямо на предметное стекло. Затем поместите срезы в 15-20 миллилитров ксилола на три минуты.

Затем погрузите ломтики в этанол понижающего качества на один час каждый, прежде чем поместить в деионизированную воду для депарафинизации и регидратации срезов. Затем используйте от 1 до 2 миллилитров 1 грамма на литр гематоксилина в течение одной-двух минут, чтобы окрашивать срезы. И переложите в воду, чтобы смыть пятно.

Теперь с помощью от 1 до 2 миллилитров 1% эозина Y и 70% этанола и разведите его в воде, запачкайте срезы на четыре-пять минут. Затем используйте проточную воду из-под крана, чтобы промыть горки. Погрузите секции в возрастающие концентрации этанола на один час каждый перед одночасовой инкубацией в ксилоле.

Наконец, нанесите на образцы базовый монтажный носитель перед добавлением покровного стекла. Затем наблюдайте под световым микроскопом при 100-кратном увеличении. С помощью дерматома возьмите сосочковые, мертвые или дермические образцы толщиной 0,6 мм, 1 мм или 0,2 мм соответственно из областей туловища четырех доноров в возрасте от 40 до 55 лет, следуя национальным правилам забора.

Поместите образцы в 0,9%NaCl и поместите на орбитальный шейкер на пять минут, чтобы аккуратно промыть ткань. С помощью 5-миллиметрового биопсийного перфоратора создайте однородные по диаметру образцы из тканей кожи, омертвевших тканей и дермы, и взвесьте все образцы тканей. Далее введите восемь, три или четыре однородных образца кожной ткани, омертвевшей или дермы, соответственно, в тканевый разрушитель, и добавьте 1,5 миллилитра физиологического раствора для дезагрегации.

Проведите дезагрегацию для всех образцов тканей, как указано в этой таблице. В качестве контроля используйте соответствующее количество пункционных биопсий, полученных из образцов интактных тканей. После механической дезагрегации аспирируют физиологический раствор, содержащий микрографты, и помещают каждый образец отдельно в одну лунку 12-луночного планшета.

Добавьте в каждый образец по 1 миллилитру среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, в каждую лунку добавляют по 1 миллилитру среды, содержащей 0,5 миллиграмм на миллилитр раствора МТТ, и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех часов. После инкубации удалите среду МТТ и замените ее 1 миллилитром ДМСО.

После инкубации в течение 10 минут перенесите каждый образец в ДМСО в кювету и используйте спектрофотометр для считывания оптической плотности на 570 нанометрах. Рассчитайте жизнеспособность клеток как коэффициент поглощения на 570 нанометрах и вес и граммы ткани, использованной до дезагрегации. Затем, после того, как физиологический раствор был аспирирован из ткани кожи, мертвых образцов и образцов дермы от одного донора, поместите каждый образец отдельно в лунку 12-луночного планшета для теста на жизнеспособность клеток или в колбу для культур для морфологического анализа.

Добавьте 1 миллилитр RPMI-1640 с 10% FBS и антибиотиками в 12-луночный планшет или 5 миллилитров в колбу для культуры и заквашивайте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов или семи дней соответственно. Через 24 часа с помощью световой микроскопии провести морфологический анализ, оценив наличие клеточной суспензии. Повторите на седьмой день.

С помощью анализа FACS анализируйте образцы дермы из мезенхимальных и гемопоэтических клеточных маркеров, таких как CD146, CD34 и CD45. Добавьте среду в десегрегированные клетки, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех дней. И оценить стерильность ткани, выполнив микробиологический анализ, как описано ранее.

Как показано на рисунке, человеческие аутологичные микротрансплантаты, немедленно нагруженные на коллагеновую опору, были имплантированы в поражение ноги. А полная реэпителизация, связанная с восстановлением тканей, наблюдалась через 30 дней. Более того, клиническое наблюдение показало хорошую текстуру и мягкость поврежденного участка уже через пять месяцев.

Как указано в этой таблице, были установлены пороговые значения в восемь, четыре и три биопсии, которые могут быть обработаны за один этап, и ткани были дезагрегированы в четыре различных периода времени с целью определения оптимальных условий дезагрегации для поддержания хорошей жизнеспособности клеток. Механическая дезагрегация, продемонстрированная в этом видео, поддерживает среднее значение жизнеспособности клеток в 30% во всех образцах кожи, мертвой и дермой, при оценке в разное время по отношению к интактной ткани. Этот трансплантат показывает, что после 24 часов, или семи дней в культуре, не наблюдалось существенных изменений жизнеспособности клеток в образцах тканей кожи к моменту гомогенизации в культуре по сравнению с начальным временем.

Тем не менее, наблюдалась сниженная жизнеспособность мертвых образцов после 24 часов в культивировании по сравнению с начальным временем. Но жизнеспособность клеток была восстановлена после семи дней в культуре. Аналогичные результаты наблюдались и в отношении дермы.

Когда эта техника будет освоена, ее можно сделать за пять минут, если она будет выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об удалении эпителиального слоя с кожи. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как дезагрегация костной ткани, чтобы ответить на другие вопросы, такие как механизм заживления костей.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регенеративной медицины и тканевой инженерии к изучению заживления тканей у пациентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять эту процедуру микрографта. Не забывайте, что работа с тканью может быть крайне опасной.

И такие меры предосторожности, как защитные очки, всегда должны приниматься во время выполнения этой процедуры.