Быстрый и упрощенный метод высокой пропускной положить Выделение микроРНК из высокоочищенной липопротеинов высокой плотности

Общая цель данного метода заключается в разработке упрощенного подхода для быстрого выделения очищенных липопротеинов высокой плотности из плазмы крови человека для анализа микроРНК. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов гепатологии и кардиологии, таких как понимание молекулярных механизмов и защитных функций липопротеинов высокой плотности. Среди основных преимуществ данной методики — возможность получения предварительно выделенных микроРНК из очищенных ЛПВП при использовании меньшего объема образцов и за короткий промежуток времени.

В данном протоколе плазма obtain из образцов периферической венозной крови, взятых натощак, путем многократного центрифугирования, как описано в тексте протокола. Перенесите плазму в новую пробирку. Измерьте плотность плазмы с помощью денситометра при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя.

Чтобы удалить циркулирующие экзосомы, являющиеся источником контаминации микроРНК, добавьте 252 µL раствора для осаждения экзосом к 1 mL плазмы. Инкубируйте смесь в течение 30 минут при температуре 4 °C. Затем центрифугируйте смесь в течение 30 минут для осаждения экзосом.

Перенесите один миллилитр полученного супернатанта в поликарбонатную пробирку для ультрацентрифугирования с толстыми стенками для дальнейшей обработки, как показано в следующем сегменте видео. Изоляция липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) осуществляется с помощью трехэтапного протокола ультрацентрифугирования в градиенте плотности, который включает последовательное выделение липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и ЛПВП. Три различных раствора плотности A, B и C должны быть свежеприготовленными в соответствии с процедурой, описанной в тексте протокола.

В поликарбонатной пробирку для ультрацентрифуги с толстыми стенками объемом 6,5 milliliter смешайте 1 milliliter плазмы и 200 microliters nuclease-free Fat Red 7B. Затем осторожно нанесите слоем 5 milliliters раствора A поверх смеси. При необходимости добавьте дополнительно Fat Red 7B поверх раствора A для балансировки веса каждой пробирки.

Поместите пробирки в предварительно охлажденный ротор. Установите ротор в напольную центрифугу и центрифугируйте в течение двух часов. По окончании цикла должны быть видны два слоя.

Удалите 1,5 milliliters верхнего слоя, представляющего фракцию VLDL, и храните его при температуре четыре degrees Celsius. С помощью пипетки перенесите четыре milliliters из нижней части пробирки в новую пробирку объемом 50 milliliters.

Данная фракция содержит ЛПНП и ЛПВП. Следующим этапом является выделение ЛПНП. Добавьте два миллилитра раствора B и 100 µL Fat Red 7B, свободного от нуклеаз, в пробирку с фракцией ЛПНП и ЛПВП.

Выдержите на льду от пяти до десяти минут. Перенесите 6,5 milliliters смешанного образца в поликарбонатную толстостенную пробирку для ультрацентрифугирования. Поместите пробирку в предварительно охлажденный ротор и центрифугируйте в течение трех часов.

По завершении центрифугирования отберите 1,5 миллилитра верхнего слоя, представляющего фракцию LDL, и храните при температуре четырех градусов Цельсия. Перенесите четыре миллилитра из нижней части пробирки, содержащей фракцию HDL, в стерильную пробирку объемом 50 миллилитров. Третьим этапом является выделение HDL.

Смешайте два миллилитра раствора C, 100 µL безнуклеазного Fat Red 7B и 15 µL 98% beta-меркаптоэтанола в пробирке, содержащей фракцию HDL. Проверьте плотность смеси. Поместите пробирку в предварительно охлажденный ротор и центрифугируйте в течение трех часов.

После этого удалите два миллилитра верхнего слоя, представляющего фракцию HDL, и храните его при температуре four degrees Celsius. Из фракций липопротеинов необходимо удалить избыток соли, чтобы избежать помех при последующем электрофорезе в агарозном геле и ПЦР. В данном видео продемонстрированы процессы обессоливания и концентрирования только для фракции HDL.

Добавьте 13 milliliters холодного PBS к фракции HDL и перенесите смесь в центрифужный фильтр с пределом отсечения по молекулярной массе 10K. Центрифугируйте в роторе с размахом при 4000 times g и температуре четыре degrees Celsius в течение 30 минут. Проведите обессоливание фракции HDL второй раз, используя 13 milliliters холодного PBS и центрифугирование в тех же условиях.

После центрифугирования удалите растворы, содержащие липопротеины, и храните их при температуре four degrees Celsius. Для оценки качества и чистоты выделенных липопротеинов был проведен электрофорез в агарозном геле с использованием стандартов липопротеинов человека в качестве эталона размера. Репрезентативные результаты выделения без добавления бета-меркаптоэтанола показали, что фракция HDL не содержит примесей VLDL и обладает типичной альфа-подвижностью.

Однако во фракции HDL также наблюдаются следы бета-подвижности из-за загрязнения липопротеинами. Добавление бета-меркаптоэтанола в раствор C на последнем этапе центрифугирования эффективно удаляет все загрязняющие липопротеины из фракции HDL. Чтобы продемонстрировать возможность количественного определения микроРНК, содержащихся в HDL человека и очищенных данным методом, была проведена амплификация двух различных микроРНК с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

На этих графиках амплификации горизонтальные линии обозначают порог детекции. Репрезентативные данные ПЦР в реальном времени для изолированных ЛПВП, полученные из шести образцов, продемонстрировали стабильное обнаружение обеих микроРНК. Наконец, анализ кривых плавления четко показывает один выраженный пик для обеих микроРНК, что свидетельствует о специфической амплификации в ходе предшествующей ПЦР.

При должном навыке и правильном выполнении данная методика, включая процедуры обессоливания, может быть осуществлена за девять часов. При выполнении этой процедуры важно постоянно поддерживать температуру от 4 до 8 °C, а также корректировать плотность каждой фракции липопротеинов перед ультрацентрифугированием.

После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как электронная микроскопия, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о чистоте ЛПВП. После внедрения эта методика позволит исследователям в области метаболического синдрома изучать ассоциированные с ЛПВП микроРНК в качестве биомаркеров у людей с подозрением на жировую болезнь печени. Она также может быть использована для более глубокого понимания функции ЛПВП и молекулярных механизмов, посредством которых они изменяют биологию клетки.