Быстрый и упрощенный метод высокой пропускной положить Выделение микроРНК из высокоочищенной липопротеинов высокой плотности

Общей целью данного метода является разработка упрощенного подхода к быстрому выделению очищенных липопротеинов высокой плотности из плазмы крови человека для анализа микроРНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы гепатологии и кардиологии, такие как понимание молекулярных механизмов и защитных функций липопротеинов высокой плотности. Некоторые основные преимущества этого метода заключаются в том, что очищенная микроРНК ЛПВП предварительно выделяется из меньшего объема образцов в течение короткого периода времени.

В соответствии с этим протоколом плазма крови получается из образцов периферической венозной крови натощак путем многократного центрифугирования, как описано в тексте протокола. Перенесите плазму в новую пробирку. И измерьте плотность плазмы с помощью денситометра при комнатной температуре, согласно инструкциям производителя.

Чтобы удалить циркулирующие экзосомы, которые представляют собой источник загрязнения микроРНК, добавьте 252 микролитра раствора осадка экзосом на один миллилитр плазмы. И инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте смесь в течение 30 минут, чтобы удалить экзосомы.

Перенесите один миллилитр полученной надосадочной жидкости в толстостенную ультрацентрифужную пробирку из поликарбоната для дальнейшей обработки, как показано в следующем видеосегменте. Выделение липопротеинов высокой плотности, или ЛПВП, осуществляется с помощью трехступенчатого протокола ультрацентрифугирования с градиентом плотности, который включает в себя последовательное выделение липопротеинов очень низкой плотности, или ЛПОНП, липопротеинов низкой плотности, или ЛПНП, и ЛПВП. Три раствора различной плотности, А, В и С, должны быть приготовлены в свежем виде в соответствии с процедурой, описанной в тексте протокола.

В толстостенной ультрацентрифужной пробирке объемом 6,5 миллилитров смешайте один миллилитр плазмы и 200 микролитров безнуклеазного Fat Red 7B. Затем аккуратно налейте поверх смеси пять миллилитров раствора А. При необходимости добавьте дополнительный Fat Red 7B поверх раствора A, чтобы сбалансировать вес каждой пробирки.

Загрузите трубки в предварительно охлажденный ротор. Поместите ротор в напольную центрифугу и центрифугуйте на два часа. В конце прогона должны быть видны два слоя.

Удалите 1,5 миллилитра верхнего слоя, представляющего фракцию ЛПОНП. И храните его при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки переведите четыре миллилитра со дна пробирки в новую 50-миллилитровую пробирку.

Он содержит фракции ЛПНП и ЛПВП. Следующим этапом является выделение ЛПНП. Смешайте два миллилитра раствора B и 100 микролитров безнуклеазного Fat Red 7B в пробирке, содержащей фракции ЛПНП и ЛПВП.

Выложите на лед на пять-десять минут. Перелейте 6,5 миллилитров смешанного образца в толстостенную ультрацентрифужную пробирку из поликарбоната. Загрузите пробирку в предварительно охлажденный ротор и центрифугуйте на три часа.

Когда центрифугирование будет завершено, удалите 1,5 миллилитра верхнего слоя, представляющего фракцию ЛПНП, и держите на уровне четырех градусов Цельсия. Переложите четыре миллилитра со дна пробирки, содержащей фракцию ЛПВП, в стерильную пробирку объемом 50 миллилитров. Третьим этапом является выделение ЛПВП.

Смешайте два миллилитра раствора C, 100 микролитров безнуклеазного Fat Red 7B и 15 микролитров 98% бета-меркаптоэтанола в пробирке, содержащей фракцию ЛПВП. Проверьте плотность смеси. Загрузите пробирку в предварительно охлажденный ротор и центрифугуйте на три часа.

После этого удалите два миллилитра верхнего слоя, представляющего фракцию ЛПВП, и держите на уровне четырех градусов Цельсия. Из фракций липопротеидов необходимо удалить излишки соли, чтобы избежать помех при последующем электрофорезе в агарозном геле и ПЦР. В этом видео будет продемонстрировано обессоливание и концентрирование только для фракции ЛПВП.

Добавьте 13 миллилитров холодного PBS к фракции ЛПВП и перенесите в центробежное фильтрующее устройство с молекулярной массой 10K. Центрифугируйте в качающемся роторе ведра, при 4000 умноженных на g, и четырех градусах Цельсия, в течение 30 минут. Обессолите фракцию ЛПВП, второй раз, используя 13 миллилитров холодной PBS, и центрифугирование, как и раньше.

После центрифугирования удалите липопротеины, содержащие растворенные вещества, и держите при температуре четыре градуса Цельсия. Для оценки качества и чистоты выделенных липопротеидов был проведен электрофорез в агарозном геле с использованием стандартов липопротеинов человека, включенных в качестве эталонного размера. Репрезентативные результаты выделения без бета-меркаптоэтанола показали, что фракция ЛПВП лишена какого-либо загрязнения ЛПОНП и демонстрирует типичную альфа-подвижность.

Тем не менее, фракция ЛПВП также демонстрирует следы бета-подвижности из-за контаминации липопротеинами. Добавление бета-меркаптоэтанола в раствор С, во время последнего этапа центрифугирования, эффективно удаляет все загрязняющие липопротеины из фракции ЛПВП. Чтобы продемонстрировать возможность количественного определения микроРНК, переносимых в ЛПВП человека, очищенных этим методом, две различные микроРНК были амплифицированы с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

На этих графиках усиления горизонтальные линии представляют порог обнаружения. Репрезентативные данные ПЦР в реальном времени из изолированного ЛПВП, полученные из шести образцов, показали последовательное обнаружение обеих микроРНК. Наконец, анализ кривой плавления ясно показывает отчетливый одиночный пик для обеих микроРНК, что согласуется со специфической амплификацией в предыдущей ПЦР.

После освоения этой техники ее можно выполнить за девять часов, вместе с процедурами обессоливания при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно постоянно работать при температуре от четырех до восьми градусов по Цельсию. И для регулировки плотности каждой фракции липопротеинов перед ультрацентрифугированием.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электронная микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как чистота ЛПВП. После его разработки этот метод позволит исследователям в области метаболического синдрома исследовать ЛПВП-ассоциированные микроРНК в качестве биомаркеров у людей с подозрением на жировую болезнь печени. Он также может быть использован для лучшего понимания функции ЛПВП и молекулярных механизмов, с помощью которых он изменяет клеточную биологию.