Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в Синегнойной

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации малых молекул, которые модулируют внутриклеточные уровни второго мессенджера cyclic-di-GMP у условно-патогенного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa с помощью высокопроизводительного биорепортерного скрининга. Этот метод может помочь обнаружить малые молекулы, которые интерферируют с биоинформацией Pseudomonas aeruginosa и другими частицами с помощью модуляции cyclic-di-GMP. Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она очень прочная и универсальная, что позволяет просеивать более 3 500 соединений в течение 48 часов.

Применение этого метода распространяется на разработку новых методов лечения, которые потенциально сенсибилизируют к Pseudomonas aeruginosa, иммунной системе или к существующим антибиотикам, оказывая при этом меньшее, селективное давление на бактерии. Внесите пять миллилитров лизогенного бульона, или LB среды, с одной колонией P. aeruginosa, семь градусов Цельсия, с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. Затем перелейте два миллилитра ночной культуры в 200 миллилитров свежей среды LB в литровую колбу и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту.

Контролируйте оптическую плотность на 600 нанометрах или наружном диаметре 600 каждые 30 минут, взяв образец объемом 1 миллилитр из колбы и исследуя его с помощью спектрофотометра. Когда наружный диаметр 600 достигнет значения от 0,3 до 0,5, поместите 40 миллилитров культуры в коническую центрифужную пробирку диаметром 50 миллиметров. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 40 миллилитрах ледяного стерильного 300 миллимолярного раствора сахарозы. После центрифугирования клеток во второй раз повторно суспендируйте в 20 миллилитрах ледяного стерильного 300 миллимолярного раствора сахарозы Снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте в 400 микролитрах 300 миллимолярного раствора сахарозы. Охладите клетки на льду в течение 30 минут, после чего они готовы к электропорации.

Затем добавьте один микролитр 0,2 микрограмма на микролитр раствора плазмиды, кодирующей промотор CdrA, к гену, кодирующему зеленый флуоресцентный белок, к 40 микролитрам приготовленных электрокомпетентных клеток P.Aeruginosa в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, предварительно охлажденной на льду. Смешайте суспензию и переложите ее в предварительно охлажденную электродную кювету с зазором между электродами и диаметром 2 миллиметра. Удалите влагу с внешней стороны кюветы с помощью папиросной бумаги и поместите кювету в камеру для образцов электропоратора.

Импульс раствора с напряжением 2,5 киловольт, конденсаторами 25 микрофарад и сопротивлением 200 Ом. Снимите кювету и добавьте один миллилитр LB среды. Затем перенесите клетки в стерильную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту.

После инкубации распределите 10 микролитров, 50 микролитров и 100 микролитров аликвот культуры на стерильные агаровые планшеты LB, снабженные ампициллином, и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Подтвердите экспрессию GFP, исследуя пластину под флуоресцентным микроскопом со стандартным каналом GFP. Выберите одну колонию и внесите в нее пять миллилитров LB. После ночной инкубации смешайте 0,5 миллилитра ночной культуры с 0,5 миллилитрами 50% глицерина в 2-миллилитровой пробирке с завинчивающейся крышкой и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

За два дня до просеивания нанесите подготовленный штамм P.aeruginosa из бульона при температуре минус 80 градусов Цельсия на агаровую пластину LB, аккуратно распределив бактерии по пластине с помощью стерильной инокуляционной петли. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Вечером накануне скрининга введите одну колонию P.aeruginosa из планшета в 10 миллилитров среды LB в пробирке.

Инкубируйте предварительную культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. В день показа подготовьте субкультуру из ночной предкультуры, разбавив ее сначала свежей средой LB до наружного диаметра 600 1,0, а затем дополнительно разбавив 5% LB до наружного диаметра 600 04. Добавьте в контейнер стерильную магнитную мешалку и перемешивайте культуру на минимальной скорости на магнитной мешалке в течение 30 минут при комнатной температуре.

Это позволяет бактериям акклиматизироваться к среде перед тем, как они будут распределены по 384-луночным планшетам. Для приготовления положительного контроля добавьте 20 микролитров тобрамицина сульфата на 10 миллилитров подготовленной субкультуры и аккуратно перемешайте. Пипеткой внесите 40 микролитров культуры положительного контроля в лунки от А23 до Р23.

Для приготовления отрицательного контроля добавьте 30 микролитров диметилсульфоксида в 10 миллилитров приготовленной субкультуры и аккуратно перемешайте. Пипеткой внесите 40 микролитров культуры отрицательного контроля в лунки от А24 до Р24. Для каждого из планшетов, увлажненных малыми молекулами, инокулируйте объем 40 микролитров разведенных за ночь культур в лунки от А1 до Р22.

Закройте планшеты воздухопроницаемой крышкой и инкубируйте в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Примерно за 30 минут до спектрофотометрического измерения предварительно нагрейте планшетный считыватель до 37 градусов Цельсия во избежание образования конденсата. Перед чтением аккуратно снимите с пластины воздухопроницаемую защитную пленку.

Затем измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нанометров с настройкой 10 вспышек на лунку и временем установления 0,2 секунды. Перед измерением флуоресценции выполните автоматическую регулировку усиления и фокусировки на основе отрицательной контрольной лунки A24 и установите целевое значение усиления на 75%Выберите регулировку фокуса и канал A в правой части окна. Измерьте флуоресценцию от репортера GFP при максимуме возбуждения 485 нанометров и максимуме излучения 520 нанометров с настройкой 10 вспышек на лунку и временем установления 0,2 секунды.

Соберите данные со всех исследованных пластин. Показания данных автоматически сохраняются по умолчанию программным обеспечением для управления считывателем пластин. Чтобы проанализировать данные, просмотрите показания, щелкнув значок Марса в управляющем программном обеспечении, чтобы открыть пакет статистического анализа.

Извлекайте данные, дважды щелкнув по интересующему вас номеру пластины, чтобы получить доступ к данным для анализа. Оцените однородность и воспроизводимость анализа с помощью надежного Z-прайм-анализа. Затем рассчитайте процент ингибирования роста и оцените процент ингибирования внутриклеточного уровня c-di-GMP, как подробно описано в текстовом протоколе.

На этом рисунке представлены репрезентативные исходные данные для наружного диаметра 600 и GFP с высокопроизводительного экрана. К значениям лунки применена карта теплового градиента с горячими и холодными цветами, указывающими на низкие и высокие значения. Сгенерированные данные анализируются на процентное торможение и представлены здесь для обоих показаний OD 600 и GFP.

Малые молекулы, которые потенциально ингибируют рост и внутриклеточные c-di-GMP, как правило, выделены зеленым цветом, в то время как малые молекулы, которые потенциально способствуют росту и внутриклеточным уровням c-di-GMP, имеют тенденцию быть красными. Диаграммы рассеяния используются для сравнения процентного ингибирования, полученного от каждой тестируемой малой молекулы. Каждая малая молекула представлена маленькой точкой, и показано процентное распределение ингибирования для каждого из показаний OD 600 и GFP.

Для идентификации попадания выбирается плюс-минус 50% отсечка. Потенциальные попадания выделены красным цветом. Для каждого интересного соединения проводятся анализы «доза-ответ».

Здесь два идентифицированных соединения были протестированы в 10-точечном анализе «доза-реакция» с максимальной концентрацией в два миллимоляра и двукратным разведением. Подгонка четырехпараметрической логистической функции к данным дала полумаксимальные значения ингибирующей концентрации для каждого соединения 158 микромоляров и 193 микромоляров. После освоения этой техники ее можно использовать для скрининга более 3500 соединений в течение 48 часов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить надежный скрининг Pseudomonas aeruginosa на наличие соединений, препятствующих передаче сигналов cyclic-di-GMP. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что условия скрининга должны быть сопоставимыми при скрининге в течение нескольких дней. Следование за одноточечным экраном с использованием того же протокола может проверить попадания.

Этот метод открывает исследователям путь к выявлению потенциальных малых молекул, которые препятствуют двуволоконной информации Pseudomonas aeruginosa и устойчивости к антибиотикам. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для использования с любыми бактериями, представляющими интерес, и может быть модифицирован для изучения других выходов или входных данных, таких как влияние на жизнеспособность бактерий. Наконец, не забывайте, что работа с Pseudomonas aeruginosa может быть опасной.

И при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение средств индивидуальной защиты.