Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации малых молекул, которые модулируют внутриклеточный уровень вторичного посредника циклического ди-GMP у оппортунистического патогена Pseudomonas aeruginosa с помощью высокопроизводительного биорепортерного скрининга. Этот метод может помочь выявить малые молекулы и другие частицы, которые вмешиваются в биоинформационные процессы Pseudomonas aeruginosa посредством модуляции уровня циклического ди-GMP. Основным преимуществом данной методики является ее высокая надежность и универсальность, что позволяет проводить скрининг более 3 500 соединений в течение 48 часов.

Значимость данного метода заключается в возможности разработки новых видов терапии, которые потенциально повышают чувствительность Pseudomonas aeruginosa к иммунной системе или существующим антибиотикам, оказывая при этом меньшее селективное давление на бактерии. Инокулируют 5 мл лизогенного бульона (среды LB) одной колонией P. aeruginosa, инкубируя при 37 °C с перемешиванием при 200 об/мин. Затем 2 мл ночной культуры переносят в 200 мл свежей среды LB в колбе объемом 1 л и инкубируют при 37 °C с перемешиванием при 200 об/мин.

Контролируйте оптическую плотность при 600 нанометрах или OD 600 каждые 30 минут, отбирая пробу объемом 1 миллилитр из колбы и анализируя ее с помощью спектрофотометра. Когда OD 600 достигнет значения от 0,3 до 0,5, перенесите 40 миллилитров культуры в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Осадите клетки, центрифугируя при 8000 об/мин в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 40 миллилитрах ледяного стерильного 300 миллимолярного раствора сахарозы. После повторного центрифугирования клеток ресуспендируйте их в 20 миллилитрах ледяного стерильного 300 миллимолярного раствора сахарозы. Снова центрифугируйте клетки и ресуспендируйте их в 400 микролитрах 300 миллимолярного раствора сахарозы. Охлаждайте клетки на льду в течение 30 минут, после чего они будут готовы к электропорации.

Затем добавьте 1 µL раствора плазмиды, содержащей промотор CdrA, связанный с геном зеленого флуоресцентного белка, в концентрации 0.2 µg/µL, к 40 µL подготовленных электрокомпетентных клеток P.Aeruginosa в микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 mL, предварительно охлажденной на льду. Перемешайте суспензию и перенесите ее в предварительно охлажденную кювету для электропорации с зазором между электродами 2 mm. Удалите влагу с внешней поверхности кюветы с помощью бумажной салфетки и поместите кювету в камеру для образцов электропоратора.

Подайте на раствор импульс с напряжением 2,5 kilovolts, емкостью 25 microfarad и сопротивлением 200 ohms. Извлеките кювету и добавьте один миллилитр среды LB. Затем перенесите клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте в течение двух часов при 37 degrees Celsius с встряхиванием при 200 rpm.

После инкубации высейте аликвоты культуры объемом 10 µL, 50 µL и 100 µL на стерильные чашки с LB-агаром, дополненным ампициллином, и инкубируйте чашки при 37 °C в течение ночи. Подтвердите экспрессию GFP, осмотрев чашку под флуоресцентным микроскопом в стандартном канале GFP. Выберите одну колонию и инокулируйте ее в 5 mL LB. После ночной инкубации смешайте 0,5 mL ночной культуры с 0,5 mL 50% глицерина в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 2 mL и храните при -80 °C.

За два дня до проведения скрининга высейте подготовленный штамм P.aeruginosa из стока при -80 °C на чашку с LB-агаром, аккуратно распределяя бактерии по поверхности среды с помощью стерильной инокуляционной петли. Инкубируйте чашку в течение ночи при 37 °C. Вечером накануне скрининга перенесите одну колонию P.aeruginosa с чашки в пробирку с 10 мл среды LB.

Инкубируйте предварительную культуру в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин. В день проведения скрининга приготовьте субкультуру из ночной предварительной культуры, сначала разбавив её свежей средой LB до OD 600 = 1,0, а затем дополнительно разбавив 5% LB до OD 600 = 0,4. Поместите в контейнер стерильный магнитный перемешиватель и перемешивайте культуру на минимальной скорости магнитного перемешивателя в течение 30 минут при комнатной температуре.

Это позволяет бактериям акклиматизироваться к среде перед их распределением по 384-луночным планшетам. Для приготовления положительного контроля добавьте 20 µL сульфата тобрамицина к 10 mL подготовленной субкультуры и осторожно перемешайте. Пипеткой перенесите 40 µL культуры положительного контроля в лунки с A23 по P23.

Для приготовления отрицательного контроля добавьте 30 µL диметилсульфоксида к 10 mL подготовленной субкультуры и аккуратно перемешайте. Перенесите пипеткой по 40 µL культуры отрицательного контроля в лунки с A24 по P24. Для каждого планшета, обработанного малыми молекулами, внесите по 40 µL разведенных ночных культур в лунки с A1 по P22.

Герметизируйте планшеты воздухопроницаемой крышкой-пленкой и инкубируйте в течение шести часов при 37 °C. Примерно за 30 минут до спектрофотометрического измерения предварительно прогрейте планшетный ридер до 37 °C, чтобы избежать конденсации. Перед считыванием аккуратно снимите воздухопроницаемую крышку-пленку с планшета.

Затем измерьте оптическую плотность при длине волны 600 нм с параметрами 10 вспышек на лунку и временем стабилизации 0,2 с. Перед измерением флуоресценции выполните автоматическую настройку усиления и фокусировки по лунке с отрицательным контролем A24 и установите целевое значение усиления на уровне 75%. Выберите настройку фокусировки и канал A в правой части окна. Измерьте флуоресценцию GFP-репортера при максимуме возбуждения 485 нм и максимуме эмиссии 520 нм с параметрами 10 вспышек на лунку и временем стабилизации 0,2 с.

Соберите данные со всех исследованных планшетов. Показания автоматически сохраняются по умолчанию программным обеспечением для управления планшетным ридером. Чтобы проанализировать данные, просмотрите показания, нажав на иконку Mars в управляющем ПО для открытия пакета статистического анализа.

Для получения данных для анализа дважды щелкните по номеру интересующей лунки. Оцените однородность и воспроизводимость анализа с помощью расчета значения Z'-фактора. Затем рассчитайте процент ингибирования роста и определите процент ингибирования внутриклеточного уровня c-di-GMP, как подробно описано в текстовом протоколе.

На этом рисунке представлены репрезентативные необработанные данные OD 600 и GFP, полученные в результате высокопроизводительного скрининга. К значениям в лунках применена цветовая градиентная тепловая карта, где переход от теплых к холодным тонам указывает на изменение значений от низких к высоким. Полученные данные анализируются для определения процента ингибирования, который здесь представлен как для показателей OD 600, так и для показателей GFP.

Малые молекулы, которые потенциально ингибируют рост и внутриклеточный уровень c-di-GMP, будут отмечены зеленым цветом, в то время как малые молекулы, потенциально стимулирующие рост и уровень внутриклеточного c-di-GMP, будут отмечены красным. Диаграммы рассеяния используются для сравнения процента ингибирования, полученного для каждой протестированной малой молекулы. Каждая малая молекула представлена небольшой точкой; показано распределение процента ингибирования для показателей OD 600 и GFP.

Для идентификации хитов выбран порог отсечения плюс или минус 50%. Потенциальные хиты выделены красным цветом. Для каждого интересующего соединения проводятся анализы зависимости «доза-эффект».

Здесь два идентифицированных соединения тестируются в анализе зависимости «доза-ответ» из 10 точек с максимальной концентрацией 2 мM и двухкратным серийным разведением. Аппроксимация данных с помощью четырехпараметрической логистической функции позволила определить значения полумаксимальной ингибирующей концентрации для каждого соединения, которые составили 158 мM и 193 мM. После освоения данная методика может быть использована для скрининга более 3 500 соединений в течение 48 часов.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как эффективно проводить скрининг Pseudomonas aeruginosa на наличие соединений, влияющих на передачу сигналов циклического-ди-GMP. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости поддерживать сопоставимые условия скрининга при работе в течение нескольких дней. После проведения одноточечного скрининга можно выполнить скрининг дозависимого отклика по тому же протоколу для подтверждения выявленных активных соединений.

Данный метод открывает перед исследователями возможности по идентификации потенциальных малых молекул, которые препятствуют передаче информации и развитию антибиотикорезистентности у Pseudomonas aeruginosa. Важно отметить, что эту методику можно адаптировать для использования с любыми интересующими видами бактерий, а также модифицировать для анализа других выходных или входных параметров, например, влияния на жизнеспособность бактерий. Наконец, не забывайте, что работа с Pseudomonas aeruginosa может быть опасной.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.