Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации клонов, экспрессирующих целлюлазу, из метагеномной библиотеки. Это достигается путем первой репликации ранее созданной метагеномной библиотеки с помощью робота после инкубации реплицированной библиотеки при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Измеряют рост клонов кишечной палочки, затем добавляют лизис, буфер и субстрат в реплицированную библиотеку.

В конечном итоге можно получить результаты, которые показывают активность целлюлазы с помощью колорметрических измерений абсорбции с помощью планшетного ридера. Здравствуйте, я Кит из лаборатории Стивена Халлама на факультете микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы покажем вам процедуру высокопроизводительного функционального скрининга метагеномных библиотек

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения активности целлюлазы biomin из метагеномных библиотек. Итак, приступим. Перед началом этого протокола подготовьте метагеномную библиотеку, хранящуюся в формате 384 луночных планшетов.

В этом исследовании использовался вектор PCC one copy control SMID в сочетании с устойчивыми клетками Farge T one TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli в качестве хоста библиотеки, чтобы начать эту процедуру, удалить планшеты, содержащие библиотеку, с минус 80 градусов Цельсия и разморозить их при 37 градусах Цельсия в течение примерно 20 минут. Между тем, используйте функцию стерилизации УФ-излучением на QIX two, чтобы стерилизовать робота в течение 15 минут. Установите Q fill three в соответствии с инструкциями производителя с помощью бутылки со средой, прикрепленной к коллектору с помощью программы стерильных трубок.

Q заполняет три для соответствующего количества среды и устанавливает объем 45 микролитров. В каждом из них хорошо продуйте воздух из трубки и коллектора с помощью функции продувки робота до тех пор, пока не станет видна среда. На каждом штифте коллектора заполните желаемое количество пластин фильтрующим материалом LB с помощью тройки Q fill.

Заполнение каждой тарелки занимает примерно 20 секунд. Затем загрузите библиотечные пластины и свежие пластины в соответствующие области пиков Q. Чтобы робот наполнил ванны для очистки соответствующими реагентами.

2% micro 90 в задней ванне, автоклавная дистиллированная вода в средней ванне и 80% этанол в передней ванне. Используя программу репликации qix two, выберите подходящую головку, а также количество и типы как исходной, так и конечной пластин. Также настройте голову для очистки между репликациями.

Обычно достаточно шести циклов в каждой бане. Производительность машины составляет 10 пластин за один раз. Запустите машину.

На его воспроизведение уйдет примерно 15 минут. Полная емкость с 384-контактной головкой. После того, как пластины будут воспроизведены, выращивайте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов в коробке с влажностью.

Длительное время инкубации необходимо, так как при добавлении арабинозы индуцируется большое число копий smid. Тем временем очистите робота Q fill three, как описано в письменном протоколе. После инкубации извлеките пластины из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия.

Отложите крышки и поместите пластины на платформу для загрузки магазина, предусмотренную быстрым стеком. Обязательно следите за порядком номерных знаков, так как программное обеспечение этого не делает. Таблички в нижней части стопки будут прочитаны.

Сначала извлеките один магазин из быстрой стопки. Убедитесь, что он пуст, и положите его на стопку пластин для чтения. Возьмитесь за магазин за рукоятку и пластина должна загрузиться в магазин.

Загрузите магазин в быструю стопку в правильной ориентации. Откройте программу сканирования на подключенном компьютере. Выберите новый сеанс и назовите его соответствующим образом.

В качестве тарелки выберите название плоское дно 384 Well plate. Введите текст в поле раскладки пластин. Нажмите кнопку мастера и выберите ее, чтобы добавить 384 неизвестных на пластину.

В области протокола выберите опцию контура скважины и введите для 384 скважин. Значок петли скважины появится в дереве потока в левой части экрана. Выберите значок и нажмите, чтобы добавить фотометрическое измерение.

Установите его на 600 нанометров. Сохраните протокол с уникальным именем и закройте программу сканирования его re. Затем откройте программу Polara RS.

На главной странице находится таблица со списком инструментов, подключенных к устройству быстрого стека, под заголовком сканирования VARI нажмите на опцию run session. После этого должно появиться окно анализа с технологической схемой посередине. Выберите элемент сеанса выполнения, затем найдите имя сохраненного сканирования.

Его повторный запуск происходит в выпадающем меню, которое появляется в правой части экрана. После выбора протокола нажмите кнопку «Выполнить». После этого анализа появится всплывающее окно с вопросом, какой журнал использовать в качестве источника, а какой пустой.

Нижняя коробка на экране соответствует передней журнальной зине. Убедитесь, что функция быстрого стека и сканирование Vario включены, и нажмите кнопку «Пуск». Быстрый стек автоматически загружает пластины в считыватель пластин, что позволяет непрерывно измерять пластины.

Наблюдайте за загрузкой первой пластины в скан Vario, чтобы убедиться в правильном выравнивании машин для считывания. 25 пластин занимает около 50 минут. После завершения сканирования Barrios извлеките весь магазин и поместите его на платформу для загрузки магазина.

Поднимите вверх внешний прямоугольник платформы, и магазин должен соскользнуть, оставив тарелки стоять кучей посередине. Наконец, замените крышки на пластинах для получения сита на основе раствора. Для повышения активности целлюлозы сначала приготовьте смесь для анализа, используя заранее приготовленный 10-кратный запас лизиса.

Смешайте 50 миллимолярный буфер ацетата калия при pH 5,5, как описано в письменном протоколе. Затем приготовьте запас до 75 мг на миллилитр, хромогенный биоцид DIPHENYL или DNP cell биоцид в ДМСО, убедившись, что субстрат полностью растворен. Добавьте в смесь для анализа стоковый раствор биоцида DNP cell до конечной концентрации 0,1 миллиграмм на миллилитр.

Имейте в виду, что на каждую пластину уходит примерно 20 миллилитров раствора, и дополнительные 50 миллилитров необходимы, чтобы учесть мертвый объем. Установите Q fill three, как и раньше, в тестовой смеси для каждой пластины, используя Q fill three. Заполнение каждой тарелки занимает примерно 20 секунд.

После добавления смеси для анализа инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов. В ящик с влажностью выньте пластины из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия. Отложите крышки и поместите пластины на загрузочную платформу магазина с быстрым стеком таким же образом, как и раньше.

Откройте программу сканирования и настройте ее так, как это было сделано ранее, за исключением фотометрического измерения, которое должно быть установлено на 400 нанометров. Затем введите параметры в программу POLARA RS. Что было продемонстрировано ранее.

Дайте сканеру Vario прочитать показания пластин. После прогона снимите и утилизируйте пластины. Чтобы экспортировать показания поглощения в открытом виде, отсканируйте его в программном обеспечении и выберите.

Откройте существующий файл. Выберите директорию, в которой была сохранена сессия, и нажмите значок плюса, чтобы развернуть список. Под заголовком заголовка будут расположены опции, помеченные как контейнер один к контейнеру N. В зависимости от количества тарелок, выберите первую тарелку для анализа в строке меню в верхней части страницы, выберите экспорт данных отчета.

Выберите параметры для экспорта, такие как компоновка пластин и фотометрические данные. Нажмите «Просмотреть отчет», затем сохраните файл. Выберите нужный каталог.

Выходной формат — электронная таблица Microsoft Excel. Здесь показания поглощения с одного 384. Планшет Well Plate, содержащий положительный клон, как показано на рисунке, положительные клоны демонстрируют заметное увеличение абсорбции по сравнению с клонами, не экспрессирующими целлюлазную активность.

Различия во времени анализа, расположении на пластине или концентрации ДНФ могут повлиять на абсолютные показатели поглощения. Относительные показатели абсорбции, такие как разница в абсорбции выше среднего по пластине или среднего по столбцу, являются более надежным методом идентификации целлюлазоположительных клонов. Мы только что показали вам, как идентифицировать целлюлазоположительные клоны из метагеномной библиотеки.

При выполнении этой процедуры важно помнить о растворении биостороны DNP-клеток в ДМСО и инкубации планшетов в камере влажности. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.