Перепрограммирование модели макрофагов, полученных из моноцитов человека, для анализов in vitro

В нашем исследовании изучалась линия моноцитов и макрофагов, подчеркивая их замечательную пластичность и способность интегрировать множественные сигналы из окружающей среды для формирования эффекторного ответа во время воспаления, восстановления тканей и инфекций. Макрофаги обнаруживаются по всему телу и координируют инициацию и разрешение врожденного и адаптированного иммунитета, влияющего на защищенную и иммуноопосредованную патологию. Перепрограммирование макрофагов является наиболее перспективной функцией в этой области.

Новые технологии омикса произвели революцию в нашем понимании биологии макрофагов, дав представление об их фенотипическом разнообразии, функциональных характеристиках, программном потенциале и происхождении развития этих клеток. Основным препятствием и подводным камнем в открытии дифференцировки и поляризации макрофагов являются гетерогенные экспериментальные условия и протоколы в литературе, а также отсутствие консенсуса в определении термина макрофагов. Мы демонстрируем перепрограммирующее действие медиаторов лекарств и липидов на поляризацию макрофагов и разрабатываем 3D in vitro модель взаимодействия между макрофагами и клетками глиобластомы.

Кроме того, мы показали, что тромбоциты лицензируют дифференцировку макрофагов, полученных из моноцитов, до фенотипа N1. Для начала поместите образцы антикоагулянтной периферической крови в центрифугу. Крутите его до 200G в течение 15 минут при комнатной температуре.

Наблюдайте за разделением обогащенной тромбоцитами плазмы сверху и клеточной фракции, включая эритроциты и лейкоциты, ниже. Клеточную фракцию, полученную в результате первого центрифугирования, разбавить стерильным PBS, предварительно подогретым до комнатной температуры. Аккуратно гомогенизируйте раствор, прежде чем приступать к центрифугированию с градиентом плотности по методу Фиколла-Гипака.

Перелейте 15 миллилитров Ficoll-Hypaque в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Осторожно и медленно добавьте 30 миллилитров разбавленной крови поверх Ficoll, обеспечивая минимальное смешивание между фазами. Центрифугируйте пробирку, содержащую Фиколл и разведенную кровь при 600 G, в течение 25 минут при комнатной температуре.

Стерильной трехмиллилитровой пастеровской пипеткой удалите часть желтого верхнего слоя. Аккуратно соберите границу раздела между желтым слоем и слоем Фиколля с помощью стерильной пастеровской пипетки. Перенесите собранные мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMC, в новую 15-миллилитровую пробирку, содержащую не менее трех миллилитров стерильного PBS.

Долить в пробирку стерильный PBS до достижения общего объема от 12 до 15 миллилитров. Затем центрифугируйте образец при 600G в течение 10 минут. Затем уменьшите суспензию PBMC при 300G в течение пяти минут при температуре от 8 до 10 градусов Цельсия.

Повторно суспендируйте клетки в нужном объеме стерильным холодом PBS с 2% FBS. Держите клетки при температуре 4 градуса Цельсия до следующего шага. Перелейте нужный объем суспензии PBMC в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.

Затем добавьте 10 микролитров положительного коктейля отбора на каждые 100 микролитров клеточной суспензии. Тщательно перемешайте суспензию перед инкубацией при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее пипетку пипеткой 10 микролитров магнитных наночастиц на 100 микролитров клеточной суспензии.

Энергично проводите пипеткой вверх и вниз более пяти раз, чтобы обеспечить равномерную суспензию магнитных наночастиц. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре добавьте в суспензию PBS, содержащие FBS и EDTA, чтобы общий объем составил 2,5 миллилитров. Аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз два-три раза.

Вставьте трубку в магнитный сортировщик и дайте ей постоять в течение пяти минут. Переверните магнит вместе с трубкой одним непрерывным движением. Держите магнит и трубку перевернутыми в течение двух-трех секунд, прежде чем вернуть их в вертикальное положение.

Снимите трубку с магнита, а затем снова добавьте в трубку 2,5 миллилитра буфера PBS-FBS-EDTA. Аккуратно пипеткой вверх и вниз два-три раза перемешайте клеточную суспензию. Вставьте трубку обратно в магнит и отложите ее в сторону на пять минут.

Одним непрерывным движением снова переверните магнит и трубку, отбросив надосадочную фракцию. Снимите трубку с магнита и снова суспензируйте элементы в соответствующем объеме PBS-FBS без ЭДТА. Теперь положительно отобранные клетки готовы к использованию.

Теперь добавьте буфер PBS-FBS к отсортированным ячейкам CD14, доведя общий объем до 12-14 миллилитров, чтобы разбавить остатки ЭДТА. Центрифугируйте при 600G в течение 10 минут. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте положительно отобранные моноциты CD14 в двух миллилитрах буфера PBS-FBS.

Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек. Держите клетки на льду до подготовки культуры. Для культивирования повторно суспендируйте гранулу в концентрации один миллион клеток на миллилитр в дополненной среде RPMI 1640.

Пипеткой внесите по 250 микролитров приготовленной клеточной суспензии в каждую лунку 48-луночного планшета. Добавьте в каждую лунку 250 микролитров среды RPMI с добавлением антибиотика, содержащей 50 нанограммов на миллилитр колониестимулирующего фактора макрофагов. Инкубируйте планшет для культивирования клеток во влажном инкубаторе, чтобы инициировать дифференцировку макрофагов.

На четвертый день дифференцировки макрофагов замените половину питательной среды из каждой лунки. Добавьте цитокины или реагенты для желаемых условий поляризации и продолжайте культивирование еще три дня. Соберите моноциты, полученные из макрофагов, на седьмой день для фенотипической характеристики.

Макрофаги M1, индуцированные интерфероном гамма-плюс липополисахаридом, демонстрировали самую высокую экспрессию CD64, отсутствие CD206 и низкие уровни CD163 и MERTK. Макрофаги M2a, индуцированные интерлейкином 4, характеризовались повышенной экспрессией CD206 и снижением уровней CD64, CD163 и MERTK. Макрофаги M2c, индуцированные интерлейкином 10 или дексаметазоном, демонстрировали повышенную экспрессию CD163 и CD14, промежуточные уровни CD64 и увеличение экспрессии MERTK.