Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный

Общая цель данной процедуры заключается в создании транспортера, обладающего достаточной стабильностью для структурных исследований, и использовании этого модифицированного транспортера для получения кристаллов, дающих дифракцию высокого разрешения при рентгеноструктурном анализе. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии, такие как решение структуры мембранных белков, которые являются важными мишенями для лекарственных препаратов. Основным преимуществом данного метода является возможность выбора конформации, связанной с лекарственным средством, с помощью функционального анализа.

Хотя этот метод позволяет изучать транспортеры нейромедиаторов, его также можно применять к рецепторам, каналам и растворимым белкам, которые с высоким сродством связывают малые молекулы. Тщательно ресуспендируйте трипсинизированные клетки HEK293S GnTI минус в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки до плотности 0,5 миллиона клеток на миллилитр в одноразовом резервуаре для пипеток. С помощью многоканального дозатора внесите по 100 мкл суспензии клеток в каждую лунку планшета, покрытого поли-D-лизином.

После заполнения каждого планшета ресуспендируйте клетки в резервуаре для пипеток, чтобы обеспечить их равномерное распределение. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C с 8% углекислого газа. Замените питательную среду за один час до трансфекции.

Подготовьте комплексы реагента для трансфекции ДНК, смешав 450 nanograms ДНК с 45 microliters безсывороточного DMEM для каждого конструкта на фоне cert TC, подлежащего скринингу. Затем добавьте 1.6 microliters реагента для трансфекции к 45 microliters безсывороточного DMEM и перемешайте. Немедленно добавьте разведенный раствор реагента для трансфекции к раствору ДНК и перемешайте.

Не смешивайте растворы в обратном порядке. Подождите 10–15 минут, прежде чем добавить 20 µL смеси ДНК реагента для трансвекции в четыре лунки. Инкубируйте клетки с 200 nM циталопрама и 25 µL TBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Для солюбилизации клеток добавьте 25 µL 8 мМ C12M, 1 мМ CHS и коктейля ингибиторов протеаз в TBS. Инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавьте в три лунки для каждого конструкта по 50 µL TBS с 20 нМ тритированного циталопрама, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и мг/мл магнитных частиц для сцинтилляционного анализа сближения (SPA) с His-тегом.

В последнюю лунку добавьте тот же раствор TBS, но с добавлением 100 мкМ сертралина для определения неспецифического связывания. Перед добавлением SPA-биссеров с аффинностью к His-тегу в 96-луночный планшет убедитесь, что они тщательно перемешаны. Измерьте связывание тритированного циталопрама с помощью 96-луночного сцинтилляционного счетчика при комнатной температуре с временем подсчета одну минуту на лунку.

Продолжайте подсчет планшетов до тех пор, пока общее числоจะไม่ выйдет на плато, примерно через 36 часов. После измерения прогрейте планшеты в течение 15 минут в нагревательном блоке с подогревом крышки при 33 °C. После нагрева повторно измерьте связывание тритиевого циталопрама.

Повторите эти шаги, изменив этап нагрева. Отрегулируйте температуру нагрева в зависимости от кажущейся температуры плавления целевого белка и термостабильности наиболее стабильной конструкции. Продолжайте нагревать планшеты до тех пор, пока все конструкции не будут иметь низкие значения удельных отсчетов.

Культивируйте клетки HEK293S GnTI минус в суспензии при 37 °C в атмосфере с 8% CO₂ и влажности 85% на шейкере при 130 RPM в среде для экспрессии 293 с добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки. Заразите 10 литров клеточной суспензии вирусом P2 с множественностью заражения 2 и плотностью 3 млн клеток/мл. Через 12–16 часов после заражения добавьте бутират натрия из 1 M стокового раствора до достижения концентрации 10 мM.

Через 48–60 часов после инфицирования соберите клетки путем центрифугирования при 4 000 ×g в течение 15 минут. Удалите супернатант. Ресуспендируйте клетки в 150 миллилитрах TBS с 2 мкМ эсциталопрама или других ингибиторов SERT.

клетки из 10 литров культуры в теплой воде при температуре примерно 30 °C и ресуспендируйте их, быстро пропуская клетки через пипетку объемом 10 мл до достижения гомогенности. Перенесите все клетки в стакан с магнитной мешалкой и при перемешивании добавьте к клеткам весь раствор детергента. Солюбилизируйте клетки при температуре 4 °C в течение одного часа при перемешивании.

Центрифугируйте лизат при 8 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C. Декантируйте супернатант в чистые ультрацентрифужные пробирки, осадок удалите. Затем центрифугируйте супернатант при 100 000 ×g в течение одного часа в ультрацентрифуге.

После ультрацентрифугирования профильтруйте супернатант через фильтр с порами 0,2 микрона, а осадок удалите. Затем пропустите лизат через 10 миллилитров стрептавидин-аффинной смолы, упакованной в колонку, используя перистальтический насос, предварительно уравновешенный промывочным буфером. После этого подключите стрептавидин-аффинную колонку к системе высокоэффективной жидкостной хроматографии белков и промойте колонку 66 миллилитрами промывочного буфера со скоростью два миллилитра в минуту.

Элюируйте очищенный белок тем же промывочным буфером с добавлением 5 мМ дестиотибиотина со скоростью 0,5 мл в минуту, используя 33 мл буфера. Собирайте фракции объемом 1 мл. Пиковые фракции составят примерно 10 мл.

Для формирования комплексов транспортера с антителами сначала проведите перенос очищенного белка в течение ночи при комнатной температуре с тромбином для удаления тегов и Endo H для дегликозилирования. Доведите концентрацию белка до 10 mg/mL при объеме от 250 до 300 µL, используя центрифужный концентратор белков с пределом отсечения молекулярной массы 100 kDa. Смешайте концентрированный белок SERT с Fab 8B6 в мольном соотношении 1:1,2, чтобы итоговый объем не превышал 500 µL.

Центрифугируйте смесь при 100 000 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. После центрифугирования соберите супернатант, содержащий комплекс Fab SERT, и удалите осадок. Разделите комплекс методом быстрой жидкостной хроматографии белков на колонке для эксклюзионного разделения.

Проведите уравновешивание с использованием дополненного раствора TBS со скоростью 0,5 мл в минуту. Перед кристаллизацией сконцентрируйте фракции пика после разделения комплекса до 2 мг/мл, используя центрифужный концентратор белков с пределом исключения по молекулярной массе 100 кДа. Абсорбция 2 AU при 280 нм соответствует концентрации 1 мг/мл.

Добавьте дополнительный Fab в соотношении 1:0,05 комплекса к свободному Fab. Также добавьте свободный S-циталопрам в концентрации 10 мкМ. После центрифугирования образца соберите супернатант, содержащий комплекс SERT-Fab, а осадок удалите.

Подготовьте систему скрининга в 24-луночном планшете методом висячей капли при температуре 4 °C в соответствии с таблицей 1 в текстовом протоколе. Пипетируйте 500 µL каждого резервуарного раствора в низкопрофильный 24-луночный планшет, предварительно нанеся герметик в каждую лунку. Пипетируйте 1,5, 1,75 и 2 µL комплекса Fab SERT на силиконизированное стеклянное покровное стекло диаметром 18 мм.

Затем нанесите пипеткой 1 µL резервуарного раствора на образец белка. Одиночные кристаллы появятся примерно через три дня и вырастут до 100–175 µm через 14 дней. Здесь представлены репрезентативные результаты скрининга термостабильности в присутствии тритированного циталопрама.

Значения температуры плавления, построенные в зависимости от максимального связывания, демонстрируют мутанты с высокой термостабильностью и экспрессией. Здесь представлены кривые термостабильности для SERT TC дикого типа и трех лучших мутантов: Y110A, I291A и T439S. На этом микроскопическом изображении показаны клетки HEK293S GnTI minus, экспрессирующие SERT CC, с зелельной флуоресценцией на клеточной мембране.

Флуоресцентное детектирование при эксклюзионной хроматографии SERT CC показывает основной пик на 15 миллилитрах. Анализ методом SDS-PAGE демонстрирует единственный вид белка, практически свободный от примесей. Показано репрезентативное разделение комплексов антител к транспортеру методом эксклюзионной хроматографии.

Основной пик, выходящий при 11,5 миллилитрах, содержал как SERT, так и Fab, что подтверждается электрофорезом в ПААГ с SDS. Световая микроскопия комплекса антител SERT, связанного с S-циталопрамом после двух недель роста, демонстрирует призмообразные кристаллы размером примерно от 100 до 175 микрон. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как идентифицировать мутации, стабилизирующие мембранный белок в конформации, связанной с лигандом, и как проводить скрининг кристаллизации для комплексов белок-антитело.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что лиганды необходимы для стабилизации SERT TC и имеют решающее значение для кристаллизации SERT CC. Значимость данного метода распространяется на терапию психических заболеваний, поскольку SERT является молекулярной мишенью многих антидепрессантов. После завершения этой процедуры функцию очищенного SERT можно охарактеризовать с помощью биохимических и биофизических методов.