Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный S -citalopram

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать транспортер, достаточно стабильный для структурных исследований, и использовать этот модифицированный транспортер для получения кристаллов, которые раздробливаются с высоким разрешением с помощью рентгеновской кристаллографии. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии, например, как решить проблему структуры мембранных белков, которые являются важными мишенями для лекарств. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно выбрать конформацию, связанную с лекарственными препаратами, с помощью функционального анализа.

Хотя этот метод может дать представление о переносчиках нейротрансмиттеров, он также может быть применен к рецепторам, каналам и растворимым белкам, которые связывают небольшие молекулы с высоким сродством. Тщательно ресуспендируют трипсонизированные HEK293S ГнТИ минус клетки в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки до плотности 0,5 млн клеток на миллилитр в одноразовом резервуаре для пипетки. С помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров клеток в каждую лунку пластины, покрытой поли-D-лизином.

Повторно суспендируйте клетки в резервуаре для пипетки после заполнения каждой пластины, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 8% углекислым газом. Замените клеточную среду за час до трансвекции.

Приготовьте комплексы реагентов для трансвекции ДНК, смешав 450 нанограммов ДНК с 45 микролитрами бессывороточного DMEM для каждой конструкции в анализируемом фоне ТЦ. Затем добавьте 1,6 микролитра трансвекционного реагента в 45 микролитров бессывороточного DMEM и перемешайте. Немедленно добавьте разведенный раствор трансвекционного реагента в раствор ДНК и перемешайте.

Не стоит смешивать растворы в обратном порядке. Подождите от 10 до 15 минут, прежде чем добавлять 20 микролитров смеси трансвекционного реагента ДНК в четыре лунки. Инкубируйте клетки с 200 наномолярами циталопрама и 25 микролитрами TBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Чтобы растворить клетки, добавьте 25 микролитров восьми миллимолярных C12M, одного миллимолярного CHS и коктейль ингибиторов протеазы в TBS. Инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавьте 50 микролитров TBS с 20 наномолярными тритиированными циталопрамами, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и миллиграммы на миллилитр его аффинного сцинтилляционного близкого анализа или SPA-гранул, в три лунки для каждой конструкции.

Для последнего хорошо добавляют тот же раствор TBS, но дополняют 100 микролярным сертралином для определения неспецифического связывания. Убедитесь, что его метка affinity SPA Бусины тщательно перемешаны при добавлении их в 96-луночную пластину. Измерьте связывание тритиированного циталопрама с помощью 96-луночного сцинтилляционного счетчика при комнатной температуре с временем подсчета в одну минуту на лунку.

Продолжайте подсчет пластин до тех пор, пока общее количество подсчетов не достигнет плато примерно через 36 часов. После измерения нагрейте пластины в течение 15 минут в нагревательном блоке с нагретой крышкой до 33 градусов Цельсия. После нагревания снова измерьте связывание тритированного циталопрама.

Повторите эти шаги с изменением этапа нагрева. Регулируйте температуру нагрева в зависимости от кажущейся температуры плавления целевого белка и термостабильности наиболее стабильной конструкции. Продолжайте нагревать пластины до тех пор, пока у всех конструкций не будет низкого удельного значения.

Выращивайте HEK293S ГнТИ минус клетки в суспензии при температуре 37 градусов Цельсия с 8% углекислого газа и влажностью 85% на шейкере при 130 об/мин и 293 сцеживающих средах с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки. Заражайте 10 литров клеток вирусом Р2 при кратности инфекции два и плотности три миллиона клеток на миллилитр. Через 12-16 часов после заражения добавьте бутират натрия в концентрации 10 миллимоляров из одного молярного запаса.

48-60 часов после заражения соберите клетки центрифугированием при 4000 G в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспензируйте клетки в 150 мл TBS с помощью 2 микромолярных эсциталопрама или других ингибиторов SERT.

Клетки из 10 литров культуры помещают в теплую воду при температуре примерно 30 градусов Цельсия и ресуспендируют их, быстро пропуская клетки через 10-миллилитровую пипетку до однородности. Добавьте все ячейки в стакан с помощью мешалки и добавьте весь раствор моющего средства в ячейки, помешивая. Растворяют клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа при перемешивании.

Вращайте лизат при температуре 8 000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость в чистые ультрацентрифужные пробирки и выбросьте гранулы. Затем вращайте надосадочную жидкость при 100 000 G в течение одного часа в ультрацентрифуге.

После ультрацентрифугирования отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,2 микрона и выбросьте гранулы. Затем пропустите лизат над 10 миллилитрами смолы сродства стрептококка, упаковывая в колонку с помощью перисальтического насоса, уравновешенного в промывном буфере. Затем подключите колонку сродства стрептококка к системе быстрой белковой жидкостной хроматографии и промойте колонку со скоростью два миллилитра в минуту 66 миллилитрами промывочного буфера.

Разведите очищенный белок в том же буфере для промывки с добавлением пяти миллимолярных дестиобиотинов в дозе 0,5 миллилитров в минуту, используя 33 миллилитров буфера. Соберите одну миллилитровую дробь. Пиковые доли будут составлять примерно 10 миллилитров.

Чтобы сформировать комплексы антител к транспортеру, сначала расщепите очищенный белок в течение ночи при комнатной температуре с тромбином для удаления меток и Endo H для дегликозилирования. Сконцентрируйте белок до концентрации 10 мг на миллилитр и объема от 250 до 300 микролитров с помощью концентратора белка с молекулярной массой 100 килодальтон. Смешайте концентрированный белок SERT с 8B6 Fab в молярном соотношении один к 1,2 в объеме менее 500 микролитров.

Центрифугируйте смесь при 100, 000 умноженных на G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. После центрифугирования соберите надосадочную жидкость, содержащую комплекс SERT Fab, и выбросьте гранулы. Разделяют комплекс с помощью быстрой белковой жидкостной хроматографии на колонке исключения размера.

Уравновешивайте его с помощью дополненного TBS в дозе 0,5 миллилитра в минуту. Перед кристаллизацией сконцентрируйте пиковые фракции от разделения комплекса до двух миллиграммов на миллилитр с помощью центрифужного концентратора белков с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон. Поглощение в две а.е. при 280 нанометрах равно одному миллиграму на миллилитр.

Добавьте дополнительный Fab в соотношении один к 0,05 комплекса, чтобы освободить Fab. Также добавьте 10 микромоляров свободного S циталопрама. После центрифугирования образца соберите надосадочную жидкость, содержащую комплекс SERT Fab, и выбросьте гранулу.

Установите подвесной экран на 24 лунки при температуре четыре градуса Цельсия согласно таблице номер один в текстовом протоколе. Пипетка по 500 микролитров каждого пластового раствора в низкопрофильную 24-луночную пластину с нанесением герметика на каждую лунку. Пипетка 1,5, 1,75 и два микролитра комплекса SERT Fab на 18-миллиметровую крышку из силиконизированного стекла.

Затем нанесите пипеткой один микролитр резервуарного раствора поверх образца белка. Монокристаллы появляются в течение примерно трех дней и вырастают до 100-175 микрометров через 14 дней. Здесь представлены репрезентативные результаты скрининга термостабильности в присутствии тритиированного циталопрама.

Значения температуры плавления, построенные в зависимости от максимального связывания, показывают мутанты с высокой термостабильностью и экспрессией. Здесь показаны кривые термостабильности для SERT TC дикого типа и трех основных мутантов: Y110A, I291A и T439S. На этом микроскопическом изображении показаны HEK293S GnTI минус клетки, экспрессирующие SERT CC с зеленой флуоресценцией, присутствующей на клеточной мембране.

Флуоресцентная эксклюзионная хроматография SERT CC показывает основной пик на уровне 15 миллилитров. Анализ, проведенный с помощью SDS-PAGE, показывает, что один вид белка в значительной степени свободен от загрязняющих веществ. Показано репрезентативное разделение комплексов антител-транспортеров методом эксклюзионной хроматографии

Основной ускользающий пик в 11,5 миллилитров содержал как SERT, так и Fab, как показано на геле SDS-PAGE. Световая микроскопия комплекса антител SERT, связанного с S. циталопрамом после двух недель роста, показывает призменные кристаллы размером примерно от 100 до 175 микрон. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать мутации, стабилизирующие мембранный белок в подтверждении, связанном с лигандом, и как настроить скрининг кристаллизации с белковыми комплексами антител.

При попытке провести эту процедуру важно помнить, что лиганды необходимы для стабилизации ТЦ SERT и имеют важное значение для кристаллизации SERT CC. Применение этой методики распространяется на терапию психических состояний, поскольку SERT является молекулярной мишенью многих антидепрессантов. После этой процедуры функцию очищенного SERT можно охарактеризовать с помощью биохимических и биофизических методов.