Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Общая цель данного метода экспрессии белков млекопитающих заключается в получении миллиграммовых количеств нативно свернутых белков, пригодных для структурных, биофизических и функциональных исследований. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой быстрый и простой протокол получения секретируемых белков млекопитающих в степени чистоты и концентрации, необходимых для структурных исследований. Как правило, мы обнаруживаем, что большинство проблем с выходом белка связаны с состоянием и жизнеспособностью клеток.

Тщательный мониторинг жизнеспособности клеток, а также контроль уровня сахара в среде позволяют значительно повысить выход белка и продлить срок использования клеток. Также крайне важно контролировать плотность клеток. Нами установлено, что если в любой момент до трансфекции плотность клеток превышает 2 миллиона клеток на миллилитр, выход белка значительно снижается. Для проведения крупномасштабного культивирования клеток 293F добавьте в один литр среды 293F 10 миллилитров 100x глутамина и пять миллилитров 100x pen strep.

Антибиотик обладает достаточной активностью в бессывороточных условиях, а снижение его концентрации повышает жизнеспособность клеток при трансфекции, что увеличивает выход белка в культуре. Клетки 293F выращивают в 300 миллилитрах среды в однолитровых поликарбонатных конических колбах с перегородками и вентилируемыми крышками при 37 °C и 8% CO₂ в стандартном инкубаторе для культур тканей с перемешиванием. За один день до трансфекции доведите плотность клеток до 0,5 млн клеток/мл в день проведения процедуры. Дополните культуральную среду, добавив 10% по объему 2% (масс./об.) раствора Cell Boost в среде для клеток 293F.

Добавьте кафу, указанную на данном этапе, для контроля гликозилирования белков. Приготовьте растворы ДНК и реагента для трансфекции в безсывороточной среде, инкубируйте в течение пяти минут. Затем добавьте реагент для трансфекции в раствор ДНК порциями по 1 мл с перемешиванием.

Осторожно инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре для формирования комплексов реагента с ДНК. Затем по капле добавьте раствор к клеткам; оставьте трансфецированные клетки для экспрессии белка на 72–96 часов для очистки гликопротеина. Сначала перелейте культуру в центрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 20 минут при 1300 Gs. Чтобы осадить клетки, соберите супернатант и, при необходимости, проведите центрифугирование повторно и/или используйте фильтр 0.22 мкм для осветления супернатанта.

Затем добавьте 10% объема 10-кратного никелевого нитро-load, три-уксусной кислоты или связывающего буфера с никелем NTA. После этого подготовьте гравитационную колонку при температуре 4 °C, добавив в колонку 2 мл суспензии никеля NTA и уравновесив ее 10 объемами колонки 1-кратного связывающего буфера при температуре 4 °C. Пропустите супернатант через смолу и соберите фракцию проскока.

После слива супернатанта промойте колонку 10 объемами промывочного буфера. Затем элюируйте белок пятью объемами элюционного буфера. Если для получения конечного объема 0,5 мл требуется дегликозилирование, сконцентрируйте EIT до 0,43 мл с помощью центрифужного концентратора; любые остатки осадка удалите центрифугированием при 16 000 ×g и температуре 4 °C.

Затем добавьте 50 µL 500 мM цитрата натрия (pH 5.5) и 20 µL endo HF. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение двух часов для удаления endo HF. Промойте амилозный сорбент трижды в фосфатно-солевом буферном растворе. Инкубируйте белок с промытым сорбентом в течение одного часа при температуре 4 °C.

После инкубации центрифугируйте образец в течение пяти минут при 1000 Gs для осаждения смолы и соберите супернатант. Концентрируйте белок, используя фильтр для центрифугирования с соответствующим пределом отсечения по молекулярной массе, и проведите замену буфера на указанный буфер для хранения. Ниже представлены репрезентативные результаты SDS-PAGE для секретируемого белка, экспрессированного в обработанных клетках cine после никель-аффинной хроматографии.

Первая дорожка представляет белок до дегликозилирования, а вторая дорожка — белок после дегликозилирования с помощью endo hf. Гликозилированный белок мигрирует примерно на 10 килодальтон выше, а затем, после одного этапа очистки и дегликозилирования, сводится к одной полосе, соответствующей предсказанному молекулярному весу. Скрининг кристаллов проводили методом «висячей капли».

На верхнем изображении показан первый полученный кристалл, а на нижнем — оптимизированные условия кристаллизации. Это демонстрирует, что биохимическая гомогенность интересующего белка может быть определяющим фактором успеха кристаллизации, и что оптимизированная система экспрессии в клетках млекопитающих позволяет получать белки, подходящие для данной кристаллизации. Дальнейшая очистка белка после никель-аффинной хроматографии легко осуществляется с помощью эксклюзионной хроматографии.

Этот этап также полезен для оценки продукции белка и оптимизации условий получения правильно свернутых белков. Исследуемый белок должен быть основным видом в хроматографическом элюате, а объем элюции должен соответствовать молекулярной массе белка. Более раннее время элюции может указывать на агрегацию или неправильную укладку белка после освоения метода.

Данная методика может быть выполнена за четыре дня при правильном соблюдении протокола. При проведении данной процедуры крайне важно поддерживать стерильные условия для культивирования клеток. Для оценки состояния олигомеризации и термической стабильности белка могут быть использованы другие методы, такие как эксклюзионная хроматография, многоугольное светорассеяние и дифференциальная сканирующая флуориметрия.