Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Общая цель этого метода экспрессии белков млекопитающих заключается в получении миллиграммовых количеств нативно свернутых белков, пригодных для структурных, биофизических и функциональных исследований. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он представляет собой быстрый и простой протокол для получения секретируемых млекопитающих белков и концентрации в чистоте, необходимой для структурных исследований. В целом, мы обнаружили, что большинство проблем с выходом белка связаны со здоровьем и жизнеспособностью клеток.

Внимательно следя за жизнеспособностью клеток, а также за уровнем сахара в средах, вы значительно улучшаете выход белка и продлеваете полезность клеток. Также очень важно следить за плотностью клеток. Мы обнаружили, что если в любое время до трансфекции количество клеток превышает 2 миллиона клеток на миллилитр, то выход белка значительно снижается.

Антибиотик обладает достаточной концентрацией в бессывороточных условиях, а сниженная концентрация антибиотика улучшает жизнеспособность клеток при трансфекции, что улучшает выход белка в культуре. 2 93 F-клетки в 300 миллилитрах среды в одном литре, поликарбонат перегородили колбы Эрленмейера с вентилируемыми крышками при температуре 37 градусов Цельсия с 8% углекислым газом во время встряхивания в стандартном инкубаторе для культуры тканей за день до трансфекции разбавили клетки до 0,5 миллиона клеток на миллилитр плотности в день трансфекции. Дополните питательную среду, добавив 10%-ный объем 2%-ного веса на объем клеточного буста в среде 2 93 F.

Добавьте кафу, наблюдаемый на этом этапе, чтобы контролировать гликозилирование белка. Приготовьте растворы ДНК и трансфективных реагентов в бессывороточных средах, инкубируйте в течение пяти минут. Далее добавьте реагент для трансфекции в раствор ДНК с шагом в один миллилитр, перемешивая.

Аккуратно инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы образовались комплексы ДНК реагента. Затем добавьте раствор в клетки по каплям, дайте трансфицированным клеткам экспрессировать белок в течение 72-96 часов для очистки гликопротеина. Сначала сцедите культуру в центрифугу для колбы в течение 20 минут при давлении 1300 Gs.To гранулируйте клетки, соберите супернат и при необходимости открутите второй раз или используйте фильтр 0,22 мкм для осветления надосадочной жидкости.

Затем добавьте 10% объема 10 x никелевого нитрозаряда, триуксусной кислоты или никелевого NTA связывающего буфера. Затем приготовьте гравитационную колонну при температуре четыре градуса Цельсия, добавив два миллилитра никелевого суспензии NTA в колонну и уравновесив 10 объемами колонны одного связующего буфера, работающего при четырех градусах Цельсия. Нанесите надосадочную жидкость на смолу и наберите поток насквозь.

После заливки надосадочной жидкости пройдите через колонну промойте 10 колонными объемами промывочного буфера. Затем разбавьте белок в пяти колоночных объемах элюирующего буфера. Если требуется дегликозилирование для конечного объема 0,5 миллилитров, сконцентрируйте EIT до 0,43 миллилитров с помощью центрифугатора-концентратора гранул от любого мусора путем центрифугирования при 16 000 GS и четырех градусах Цельсия.

Затем добавьте 50 микролитров 500 миллимоляров цитрата натрия, pH 5,5 и 20 микролитров эндо hf. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение двух часов, чтобы удалить эндо HF, сначала промойте амилозу три раза в фосфатном буферном растворе. Инкубируйте белок с промытой смолой в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия.

После инкубации вращайте в течение пяти минут при давлении 1000 G, чтобы гранулировать смолу и собрать надосадочную жидкость. Концентрируйте белок с использованием соответствующего среза молекулярной массы, центрифугирующего фильтра и замены буфера в буфер для хранения, показанный на рисунке. Ниже приведены репрезентативные результаты страницы SDS для секретируемого белка, экспрессируемого в обработанных клетках после аффинной хроматографии никеля.

Первая полоса — это белок до дегликозилирования, а вторая полоса — белок после дегликозилирования эндо hf. Гликозилированный белок поднимается примерно на 10 килодальтон вверх, а затем коллапсирует в одну полосу, соответствующую прогнозируемой молекулярной массе, после дегликозилирования, после одной стадии очистки. Хрустальные экраны были установлены методом висячих капель.

На верхнем изображении показано первоначальное попадание кристалла, а на нижнем — оптимизированные условия кристаллизации. Это демонстрирует, что биохимическая однородность интересующего белка может быть определяющим фактором для успеха кристаллизации, а оптимизированная система экспрессии млекопитающих производит белки, пригодные для такой кристаллизации. Дальнейшая очистка очищенного никелем белка легко выполняется с помощью эксклюзионной хроматографии.

Это также полезный шаг на пути к оценке производства белка и оптимизации условий для получения правильно свернутых белков. Представляющий интерес белок должен быть основным веществом в хроматографическом элюировании, а объем элюирования должен соответствовать молекулярной массе белка. Раньше. Время ЕАЭС может указывать на агрегацию или неправильное сворачивание белка после освоения.

Эту технику можно выполнить за четыре дня при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры важно поддерживать стерильные условия для клеточной культуры после этой процедуры. Другие методы, такие как размер, эксклюзионная хроматография, многоугловое рассеяние света и дифференциальное сканирование, флуориметрия, могут быть выполнены для оценки состояния олиизации и термической стабильности белка.