Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Общая цель этой процедуры заключается в быстром выявлении и тестировании возможных границ доменов в больших белках с спиральной спиралью для повышения вероятности нахождения собственного фрагмента, который будет кристаллизоваться. Этот метод может помочь исследователям оптимизировать процесс кристаллизации больших белков со спиралью, которые, как известно, могут быть сложными для кристаллизации. Преимущество этого метода заключается в том, что он объединяет как экспериментальные, так и вычислительные методы для быстрого выявления и скрининга вероятных кандидатов на кристаллизацию, тем самым повышая их шансы на успех.

Эту технику продемонстрируют Дженна Залевски, аспирант моей лаборатории, и Кит О'Конор, студент-исследователь в моей лаборатории. Для начала объедините выходные данные установленных веб-инструментов для создания прогнозов возможных границ домена спиральной катушки, как описано в текстовом протоколе. После создания экспрессирующих плазмид и проверки их уровней экспрессии, как подробно описано в тексте, начните очистку каждого штамма, который успешно экспрессировал белок, меченный рубином.

Чтобы лизировать клетки, сначала ресуспендируйте каждую размороженную клеточную гранулу в 1,5 миллилитрах буфера для лизиса, который был дополнен ингибиторами протеазы. Добавьте 30 микролитров лизоцима в концентрации 10 миллиграммов на миллилитр и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут, затем обеспечьте ультразвуком, следуя инструкции к используемому инструменту. Центрифугируйте образец в настольной центрифуге в течение 30 минут при 14 000 G для гранулирования нерастворимого материала или нелизированных клеток.

Сохраните надосадочную жидкость и гранулу для последующего анализа с помощью SDS-PAGE. Чтобы выполнить очистку сродства к никелю, сначала инкубируйте 100 микролитров гранул NTA никеля, предварительно промытых в буфере для лизиса с растворимым лизатом в течение 5-10 минут. Переверните суспензию несколько раз, чтобы перемешать бусины.

Центрифугируйте образец при 800 умноженных на G в течение 30 секунд в настольной центрифуге, чтобы гранулировать гранулы. После этого промойте гранулу от трех до пяти раз лизисным буфером для очистки от неспецифических загрязнений. Наконец, вымывайте белок слияния рубина из гранул с помощью буфера для лизиса, дополненного одним молярным имидазолом.

Используйте спектрофотометр, установленный на 280 нанометров, чтобы измерить концентрацию белка-синтеза Ruby, затем оцените однородность образца, загрузив от одного до пяти микрограммов белка-синтеза в нативный гель PAGE. Запустите 10%-ный гель PAGE при температуре четыре градуса Цельсия в течение 140 минут при напряжении 175 вольт. Визуализируйте нативную страницу с помощью тепловизора, оснащенного для визуализации флуоресценции, наблюдая, куда мигрирует слияние с рубиновой меткой в этом анализе.

Проведите ограниченный протеолиз для идентификации стабильно свернутых доменов путем предварительной инкубации 95 микролитров синтеза Ruby-Shroom SD2 с пятью микролитрами 0,025 субтилизина А. Проведите реакцию в моментах нуля, 0,5, двух, пяти, 15, 60 и 120 минут, удалив из реакции по 10 микролитров для каждого временного момента и визуализируя ход реакции с помощью SDS-PAGE с использованием 15% акриламидного геля. Окрасьте гель синим цветом Кумасси, чтобы оценить, можно ли идентифицировать вид, устойчивый к протеазе. Интегрируйте данные об эффективности очистки, поведении в нативном PAGE и ограниченном протеолизе на частично очищенных гибридных белках mRuby2-Shroom в комплексную оценку общего поведения этих белков в растворе.

Выполняйте крупномасштабные сцеживания с помощью двух литровых культур mRuby2-Shroom SD2 с целью получения от пяти до 20 миллиграммов полностью очищенного образца. После роста клеток гранулируйте клетки центрифугированием при 8000 G в течение 10 минут. Полученная клеточная гранула может храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока она не понадобится.

Затем повторно суспендируйте гранулу примерно в восьми миллилитрах лизисного буфера на грамм замороженной клеточной гранулы. Лизируйте повторно суспендированные клетки с помощью гомогенизатора. После лизиса клеток гранулируйте клеточный мусор с помощью центрифугирования в 30 000 раз больше G в течение 30 минут.

Далее замес связывают растворимую фракцию с помощью 10 миллилитров предварительно промытой никелевой смолы NTA. Вылейте суспензию гранул в соответствующую гравитационную колонну и дайте стечь несвязанным белкам, затем промойте смолу от трех до пяти раз 40 миллилитровыми буфером для лизиса, после чего промывайте буфером для лизиса с добавлением одного моляра хлорида натрия. Проведите окончательную промывку смолы 40 миллилитрами лизисного буфера с добавлением 80 миллимоляров имидазола.

Разбавьте гибридный белок Ruby-Shroom 40 миллилитрами буфера для лизиса, содержащего один моляр имидазола. Вручную фракционируйте элюированный белок на фракции от четырех до 10 миллилитров. Подтвердите наличие фракций, содержащих белок для синтеза рубина и грибов, с помощью 10% геля SDS-PAGE.

Добавьте один миллиграмм протеазы TEV на каждые 25-50 миллиграммов гибридного белка, чтобы удалить рубиновую метку. Затем диализуйте соответствующие фракции в буфер для расщепления TEV с помощью диализной трубки с молекулярной массой от шести до восьми килодальтон. Диализируйте белок в течение ночи при комнатной температуре при медленном перемешивании.

После диализа повторите этапы аффинной очистки никелем. Домен Shroom-SD2 должен протекать в несвязанную фракцию, в то время как рубиновая метка остается связанной со смолой. С помощью спинового концентратора сконцентрируйте пиковые фракции примерно до 10 мг на миллилитр, затем проведите эксклюзионную хроматографию, анализируя пиковые фракции с помощью геля 12% SDS-PAGE.

После объединения пиковых фракций диализуйте раствор в кристаллизационный буфер, затем концентрируйте диализованный белок до 10 мг на миллилитр перед кристаллизацией. Проведите скрининг небольшого массива из 12 условий, чтобы определить оптимальную концентрацию белка для испытаний кристаллизации, используя 24 луночно сидячих кристаллизационных тарелки. Выполните испытания кристаллизации с использованием метода диффузии пара.

Сначала пипетку по 500 микролитров каждого из 12 условий в отдельные лунки. На каждом постаменте сделайте капли, которые содержат один микролитр луночного раствора и один микролитр протеинового образца. Быстро запечатайте лоток прозрачной лентой, затем переместите лоток в подходящую среду с регулируемой температурой и без вибрации.

Исследуйте капли в лотках в течение следующих трех дней с помощью микроскопа с увеличением до 100X. В конце трехдневного периода оцените каждую каплю как не содержащую осадков, легких осадков, сильных осадков или кристаллов. Подходящая концентрация белка должна содержать не более шести тяжелых осадков.

Используя определенную концентрацию белка, провести скрининг широкого спектра коммерчески доступных кристаллизационных экранов. Использование робота для работы с жидкостями или кристаллизации значительно ускоряет этот процесс, а также сводит к минимуму погрешность при падении. Он требует гораздо меньше белка, что позволяет пользователю проверять больше условий с помощью одного образца.

Улучшите начальные условия, определенные с помощью широких сит, систематически изменяя каждую из переменных в пределах капли кристаллизации с использованием 24-луночных ситовых тарелок, как и раньше. Ограниченный протеолиз используется для идентификации областей белка, которые могут быть гибкими или иным образом более доступными для протеазы. Здесь показана схема деградации для домена SD2, который является протеолитически чувствительным, и другого, который достаточно стабилен.

Ограниченный протеолиз проводили в контексте слияния белков рубина. В этом случае линкерная последовательность между Ruby и доменом SD2 была быстро расщеплена, как и ожидалось, но полученные фрагменты Ruby и SD2 остались в основном стабильными. Анализ с помощью нативного PAGE может быстро выявить хороших кандидатов на кристаллизацию.

Четыре комплекса Shroom-Rock с разными белковыми батареями работали на нативных гелях PAGE. Комплекс, содержащий породы с 834 по 913, показал наилучшие характеристики и легко кристаллизовался, в то время как остальные кристаллизовались только при деградации или не смогли кристаллизоваться полностью. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разработать набор потенциальных доменных границ для белка с большой спиральной катушкой и как использовать систему Ruby для быстрого и быстрого определения лучших кандидатов на кристаллизацию.

В то время как кристаллография остается трудоемким занятием, использование этого метода сфокусирует ваш поиск белков, которые будут кристаллизоваться с помощью простых анализов для удаления плохих кандидатов, что позволит вам потратить больше времени на кандидатов с лучшими шансами на успех. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать включать как можно больше информации при выборе возможных границ домена. Информация, которую вы выбираете при использовании этой процедуры, будет варьироваться для каждого белка.

Если это возможно, следует использовать другие методы, такие как клеточный или биохимический анализ, чтобы убедиться, что рассматриваемые фрагменты белка по-прежнему содержат функцию, представляющую биологический интерес. Несмотря на то, что этот метод ориентирован на белки со спиралью, общая структура может быть легко адаптирована практически для любого белка. Не забывайте, что работа с определенными инструментами и биологическими реагентами может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток или ношение защитных очков.