Методика изучения горизонтальных генного переноса в Стафилококк

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы предоставить подробную методологию для изучения горизонтальной передачи ДНК в золотистом стафилококке с учетом трех основных путей переноса. Конъюгация, трансдукция и естественное превращение. Этот метод заключается в горизонтальном переносе устойчивых к антибиотикам генов в патогенном стафилококке золотистого стафилококка человека.

Основное преимущество представленных здесь методов заключается в том, что мы можем протестировать три основных способа переноса, включая недавно обнаруженную естественную генетическую трансформацию. Чтобы начать эксперимент, приготовьте пять миллилитров на ночь культуры бактерий донора и реципиента в триптическом соевом бульоне. Или БГБ среды с 32 миллиграмм на литр левомицетина и без соответственно.

С встряхиванием при 37 градусах Цельсия. На следующий день отрегулируйте оптическую плотность ночных культур до плотности со свежей средой TSB. Смешайте 0,5 миллилитра донорской культуры с 0,5 миллилитрами реципиентной культуры.

И добавьте в смесь один миллилитр фосфатно-солевого буфера, или PBS. Затем с помощью системы вакуумного насоса перенесите смесь бактерий на фильтрующую мембрану размером 0,45 микрометра. Поместите фильтрующие мембраны на агаровую пластину из овечьей крови.

Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного дня. Выньте фильтрующую мембрану из тарелки и суспензируйте ее в 10 миллилитрах PBS. Вортсируйте смесь примерно на одну минуту, чтобы собрать все бактерии, прикрепленные на мембране.

Производят серийное 10-кратное разбавление бактериальной суспензии свежим TSB. Пластина 100 микролитров из 0, 10, 4 разведенных образцов на БСЭ агара. Или планшеты TSA с добавлением 32 миллиграммов на литр левомицетина и восьми миллиграммов на литр тетрациклина для отбора трансконъюгантов.

Нанесите 100 микролитров разведенной суспензии на планшеты TSA с восемью миллиграммами на литр только тетрациклина. Чтобы подсчитать общее количество получателей. После инкубации проанализируйте колонии с двойной резистентностью на наличие гена CFR с помощью ПЦР колонии и профили их восприимчивости.

Определите антибиотикограмму путем измерения минимальных ингибирующих концентраций (MICs) соответствующих антибиотиков в соответствии со стандартным методом микроразведения или методом дисковой диффузии. Профиль чувствительности трансконъюгантов должен быть идентичен реципиенту. За исключением хлорамфеникола и других соединений, на которые влияет ген CFR.

Исключить резистентность к тетрациклину, развившуюся у донорского штамма. Приготовьте на ночь культуру N315-45 в пяти миллилитрах питательного бульона с добавлением 3,6 миллимоляра кальция. Подготавливают субкультуры, разводя за ночь культуру один к 1000 в конечном объеме 10 мл в стеклянных флаконах по 50 мл.

Выращивайте бактерии в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием, 180 оборотов в минуту. Далее готовят ряд разведенных фагов MR83a в среде NB хлорида кальция. Добавьте 20 микролитров разведенного фага в бактериальную культуру.

Приготовьте контрольную культуру без фаговой инфекции, которая будет служить положительным контролем для роста бактериальных клеток. Затем выращивайте культуры при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием со скоростью 100 оборотов в минуту в течение ночи. На следующий день выберите один или два очищенных флакона с культурой с наибольшим разведением добавленного фага.

Переложите культуры в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров. Добавьте в пробирки 250 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте культуру, перевернув их. Центрифугируйте культуру при 5 000 G в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия.

Переложите надосадочную жидкость в свежие пробирки и храните их при температуре 4 градуса Цельсия до использования. Приготовьте питательный отвар агар среднего размера и держите его в тепле на водяной бане при температуре 55 градусов тепла. Добавьте в среду автоклавированный 0,5-молярный раствор хлорида кальция до конечной концентрации 3,6 мкмоль

Вылейте его в 90-миллиметровые чашки Петри NB пластины с хлоридом кальция. Приготовьте на ночь культуру N315 в пяти миллилитрах NB хлорида кальция при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. На следующий день добавьте 10 микролитров ночной культуры в 200 микролитров хлорида кальция NB и равномерно распределите его на пластине хлорида кальция NB.

Прекращайте растекание, когда поверхность пластины покроется жидкостью. Затем дайте тарелке высохнуть в течение пяти минут. Производят серийное разведение один к 10 ранее приготовленного фага с использованием NB среды хлорида кальция.

Нанесите по три микролитра каждого разведенного фага на пластину, покрытую бактериями. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. На следующее утро подсчитайте количество бляшек и рассчитайте титр фагов с помощью следующего уравнения.

Приготовьте на ночь культуру N315, COL или MU50 в пяти миллилитрах NB хлорида кальция при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием со скоростью 180 оборотов в минуту. После ночного культивирования разведите фаг в NB хлориде кальция до 109 БОЕ на миллилитр. В стеклянном флаконе объемом 50 миллилитров смешайте 500 микролитров ночной культуры, 500 микролитров свежего хлорида кальция NB и один миллилитр фага 109 PFU на миллилитр.

Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием со скоростью 100 оборотов в минуту в течение 30 минут. После инкубации добавьте в культуры 50 микролитров 20%-ного цитрата тринатрия. Продолжайте осторожное встряхивание в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Приготовьте расплавленный мозговой сердечный настой или агаровую среду BHI и держите его на водяной бане при температуре 55 градусов Цельсия, а также обработайте агаровую среду 32 миллиграмм на литр левомицетины. Затем переложите бактериальную фаговую смесь в колбу объемом 100 миллилитров. Добавьте 50 миллилитров теплого агара BHI с добавлением 32 миллиграмм на литр левомицетина и хорошо перемешайте.

Разлейте смесь по 90-миллиметровым чашкам Петри. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию. Далее протестируйте образованные колонии, трансдуктанты, на устойчивость, перенеся колонии на новые агаровые пластины BHI с добавлением хлорамфеникола 32 миллиграмма на литр.

Подтвердите наличие гена CFR методом ПЦР с колонией. Культивируйте клетку-реципиента в течение ночи, в пяти миллилитрах TSB при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. На следующее утро перелейте 0,5 миллилитров ночной культуры в 1,5-миллилитровую пробирку.

Осаждайте клетки путем центрифугирования. Затем суспензируйте клетки с 10 миллилитрами среды CS2 в 50-миллилитровую трубку. Затем выращивают бактерии при температуре 37 градусов по Цельсию с встряхиванием со скоростью 180 оборотов в минуту в течение восьми часов до поздней экспоненциальной фазы.

Соберите клетки с помощью центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах свежей среды CS2. Добавьте в клеточную суспензию 10 микрограммов очищенной плазмиды или геномной ДНК.

Встряхивайте культуру со скоростью 180 оборотов в минуту. Затем соберите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды BHI.

Смешайте клеточную суспензию с 90 миллилитрами расплавленного агара BHI с добавлением 32 миллиграммов на литр хлорамфеникола и пятью микрограммами на литр тетрациклина в контрольном эксперименте. Вылейте смесь в 90-миллиметровые чашки Петри и быстро остудите и дайте агару застыть. Реплицируйте колонии с помощью зубочисток на планшеты, содержащие соответствующие антибиотики, чтобы подтвердить их характеристики устойчивости.

Протокол конъюгации полезен для внутривидовой передачи, когда в качестве донора CFR использовался staphylococcus epidermidis. А в качестве реципиента использовался штамм Staphylococcus aureus N315. Протокол, используемый для межвидовой передачи, дает аналогичные результаты при использовании одного и того же конъюгативного вектора у разных конъюгативных доноров.

Это первая работа, в которой описаны детали естественного преображения. Представленная методология будет полезна исследователю для изучения передачи и распространения устойчивости к антибиотикам, а также первичной детерминанты в патогене человека золотистом стафилококковом стафилококке.