Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных

Этот протокол описывает, как оценить экспрессию большого массива генов на клоновых уровне. Одноклеточный RT-КПЦР производит весьма надежные результаты с сильной чувствительностью для сотен образцов и генов.

Общая цель этого эксперимента — наблюдать экспрессию множественных генов в отдельных клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как гетерогенность молекулярных сигнатур в клеточной популяции или редкая молекулярная сигнатура. Основное преимущество этого метода заключается в том, что специфические молекулярные сигнатуры, содержащие не менее 48 различных генов, могут быть оценены во многих клетках одновременно.

Начните эту процедуру с приготовления смеси для предварительного амплификации на 48 реакций в пробирке объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в пробирку 240 микролитров специфического буфера для ретротранскрипции, 62,4 микролитра буфера с низким содержанием ЭДТА TE и 9,6 микролитров Taq ДНК-полимеразы. С помощью электронной пипетки распределите по 6,5 микролитров смеси предварительного усиления в каждую из 48 лунок в 96-луночном одноклеточном планшете.

Далее приготовьте смесь для анализа 0,2x в пробирке объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в тюбик по 1,4 микролитра каждой грунтовки. Отрегулируйте конечный объем до 140 микролитров с низким содержанием ЭДТА TE в буфере.

С помощью электронной пипетки распределите 2,5 микролитра смеси для анализа 0,2x в 48 лунках в 96-луночном сортировочном планшете для одноклеточных элементов, содержащем смесь для предварительной амплификации. Запечатайте пластину защитной пленкой. Сделайте пластину вихрем и вращайте ее со скоростью 280 g в течение одной минуты.

Одиночные врожденные лимфоидные клетки печени, или ВЛК, будут сортироваться с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. Начните эту процедуру с использования пустого 96-луночного планшета в качестве теста. Расположите тестовую пластину на держателе пластины так, чтобы лунка находилась слева и по направлению к экспериментатору.

Отрегулируйте держатель пластины так, чтобы в центре лунки получилась капля с проверочными бусинами. После правильной регулировки поместите 96-луночный сортировочный планшет с одиночными ячейками, содержащий смесь для анализа и предварительное усиление, на держатель планшета. Нарисуйте схему табличек и отсортируйте по одной ячейке на лунку закрытого населения.

Правильное расположение каждой ячейки на 96-луночной сортировочной пластине с одной ячейкой имеет важное значение, а расположение пластин должно храниться в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Оставьте одну лунку, содержащую смесь для анализа 0,2x и смесь для предварительной амплификации, без клеток, в качестве контроля без ввода. При необходимости оставьте два ряда по шесть лунок для разведения кДНК в качестве контроля эффективности праймера.

Сразу после сортировки одиночных ячеек сделайте вихревой и вращайте 96-луночную сортировочную пластину с одним элементом. Поместите пластину в амплификатор. Выполните обратную транскрипцию и предварительное усиление в соответствии с указаниями.

Предварительная амплификация специфических генов-мишеней на отсортированных одиночных клетках требуется для того, чтобы получить достаточное количество материала. Разбавьте предварительно амплифицированные образцы, добавив в каждую лунку 36 микролитров буфера с низким содержанием ЭДТА TE. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 191 микролитр мастер-смеси путем пипетирования 175 микролитров мастер-смеси для количественной ПЦР и 17,5 микролитров реагента для загрузки образца в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

На новой 96-луночной пластине распределите по 3,6 микролитра Master Mix на каждую из 48 лунок. Это 96-луночная пластина для образцов. Перенесите 2,9 микролитра предварительно амплифицированной кДНК из 96-луночного сортировочного планшета для одиночных клеток на новый 96-луночный планшет для образцов, сохраняя одно и то же положение для каждого образца между двумя планшетами.

Приготовьте планшет для анализа на 96 лунок, распределив по три микролитра реагента для загрузки анализа на каждую из 48 лунок на новом планшете на 96 лунок. Добавьте по три микролитра грунтовки в каждую лунку. Правильное расположение каждого праймера в 96-луночном испытательном планшете имеет важное значение.

Храните раскладку тарелок в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Чтобы начать эту процедуру, поместите интегрированный микрофлюидный контур (IFC) на стенд и проверьте клапаны с помощью шприца. Снимите колпачок шприца, поставьте его перпендикулярно одному клапану и плотно нажмите.

Уплотнительное кольцо должно сдвинуться. Заполните стружку жидкостью для управляющей магистрали. Повторив предыдущие действия со вторым клапаном, удалите черную пленку с нижней части чипа.

Загрузите микросхему в контроллер IFC. На экране контроллера IFC выберите prime, а затем выполните запуск. Затем извлеките чип и снова запечатайте черную пленку на нижней части чипа.

С помощью восьмиканальной пипетки перенесите пять микролитров с 96-луночного планшета на левую сторону чипа. Меняйте наконечники для каждой лунки чипа. Избегайте образования пузырей, а если они появились, используйте 10 микролитровых наконечников для их удаления.

Заполните левую сторону фишки, как указано на рисунке. Таким же образом заполните правую сторону чипа, используя пять микролитров из 96-луночной пластины для образца. Для успеха этого эксперимента важно, чтобы микросхема IFC была правильно заполнена для правильной загрузки в контроллер IFC.

Удалите синюю пленку с нижней части микросхемы и загрузите микросхему в контроллер IFC. На экране контроллера IFC выберите «Загрузить микс», а затем выполните. По завершении извлеките чип и снова запечатайте синюю пленку на нижней части чипа.

Чтобы запустить чип, сначала выберите программное обеспечение для сбора данных на микрофлюидном компьютере для количественной ПЦР. Как только он начнется, выберите новый запуск. Выберите «Извлечь» и загрузите микросхему.

После настройки программного обеспечения, как описано в текстовом протоколе, нажмите кнопку «Запустить запуск». Реакция займет примерно 90 минут. Чтобы начать анализ данных, откройте программное обеспечение для анализа ПЦР в реальном времени, выберите файл и откройте, найдите папку эксперимента и выберите чип run dot b m one file.

Нажмите на представление анализа, таблицу результатов и просмотр тепловой карты. Поля, отмеченные значком x, находятся ниже порогового уровня обнаружения и/или имеют плохие кривые усиления. Присвойте образцам имена.

Перейдите к настройке примера и выберите новую SBS 96. Нажмите на кнопку «Сопоставление» и выберите схему образца в соответствии со схемой 96-луночной пробоотборной пластины. Скопируйте и вставьте образец макета из программного обеспечения для работы с электронными таблицами.

Определите вставленный макет в качестве имени образца. Используйте ту же процедуру для именования анализов. Введите имена праймеров в настройках детектора и определите вставленную схему в качестве имени детектора.

Нажмите на вид анализа и проанализируйте. Выберите файл, экспортируйте и сохраните как результаты тепловой карты. С помощью проточной цитометрии популяции ILC печени были отсортированы на основе широко экспрессированных маркеров ILC, и были определены три различные популяции.

Правильно загруженный одноклеточный мультиплексный чип экспрессии генов должен иметь прямые линии и ряды, каждая реакционная камера должна быть заполнена и находиться в одном и том же размере. Неправильно загруженный чип будет иметь пустые линии и ряды реакционных камер, а также линии изгиба. Этот флуоресцеиновый аминитный рисунок правильно загруженного чипа показывает различия в яркости реакционной камеры, проявляющиеся после нескольких циклов.

Реакционные камеры с усилительным сигналом выглядят ярче, чем реакционные камеры без сигнала усиления или с низким уровнем усиления. После надлежащей сортировки клеток, предварительной амплификации и загрузки популяция ILC оказалась неоднородной по экспрессии генов в печени взрослых мышей дикого типа. Слева находится тепловая карта без изменений.

Справа представлена модифицированная тепловая карта, полученная после определения образца и названия пробы. С помощью онлайн-программного обеспечения были определены сигнатуры экспрессии генов, специфичные для клеток, и отношения между клеточными популяциями. Каждая строка представляет ген, каждая строка представляет одну и ту же клетку, а три популяции клеток представлены синим, красным и зеленым цветами.

Одну, освоив одну, эту технику можно сделать за девять часов, если выполнить ее правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно тщательно отслеживать ориентацию пластины для распределения клеток и праймеров. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей к изучению редких и специфических молекулярных сигнатур в клеточных популяциях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценить экспрессию нескольких генов во многих отдельных клетках одновременно, после правильной сортировки клеток, предварительной амплификации и загрузки.