Кинематический анализ клеточного деления и расширения: Количественная клеточная основа роста и отбора проб Развивающие зон в Zea Mays Листья
2 декабря 2016 г.
Количественная оценка деления и расширения клеток имеет решающее значение для понимания роста всего растения. В этой статье мы представляем протокол для расчета клеточных параметров, определяющих скорость роста листьев кукурузы, и рассказываем об использовании этих данных для исследования механизмов регуляции молекулярного роста путем разработки стратегий отбора проб для конкретных стадий развития.
Общие цели этого анализа заключаются в том, чтобы определить клеточную основу роста листьев кукурузы и использовать эти данные для исследования механизмов регуляции молекулярного роста путем выполнения стратегий отбора проб для конкретных стадий развития. Этот метод может помочь решить ключевой вопрос биологии развития растений. Как деление и размножение клеток влияют на различия в росте всего органа?
Этот подход позволяет исследовать и пространственно картировать биохимические молекулярные и физиологические процессы, лежащие в основе роста всего растительного органа. Хотя эта система может дать представление о росте листьев кукурузы, этот метод может быть использован и для других систем. В том числе и другие виды трав, и органы.
Визуальная демонстрация этих методов имеет решающее значение. При сборе урожая библирование образца и измерительные операции трудно выполнить без этой демонстрации. Демонстрировать процедуру будут Катрин Шпрангер и Виктория Аврамова.
Два аспиранта из моей лаборатории. Чтобы провести полный хенематический анализ роста листьев у однодольных, выращивайте не менее 15 растений для каждой обработки и генотипа в контролируемых условиях в комнате для выращивания. Когда появляется лист, представляющий интерес, используйте линейку, чтобы измерить длину листа, то есть длину от почвы до кончика листа, ежедневно до тех пор, пока лист полностью не раскроется.
На интересующей стадии развития срежьте надземную часть растения по крайней мере от пяти репрезентативных растений как можно ближе к корням, чтобы сохранить меристемную область нетронутой. Затем, начиная с внешних листьев, аккуратно разверните все листья до интересующего листа, один за другим. Удаляем несколько лишних миллиметров от основания, чтобы отделить листья по мере необходимости.
Затем удалите верхушку и маленькие листья, окруженные интересующим листом, и отрежьте трехсантиметровый сегмент от листа, начиная от основания с одной стороны средней жилки. Очень важно срезать лист точно в том месте, где он соединяется со стеблем. Так как уменьшение до высокого уровня приведет к недооценке размера меристемы.
Храните сегмент в пробирке объемом 1,5 миллилитра, заполненной тремя двумя однообъемными растворами абсолютной этанола уксусной кислоты, при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов до нескольких месяцев. С другой стороны вены отрежьте 11-сантиметровый отрезок от основания и храните этот сегмент в 15-миллилитровой пробирке, наполненной абсолютным этанолом, при температуре четыре градуса Цельсия не менее шести часов, чтобы удалить пигменты. После второго 24-часового раунда в абсолютном этаноле при температуре четыре градуса Цельсия замените этанол чистой молочной кислотой и храните сегмент при температуре четыре градуса Цельсия еще 24 часа или до дальнейшего анализа.
Чтобы измерить меристему, сначала переложите трехсантиметровый сегмент листа в свежеприготовленный буфер для промывки на 20 минут. По окончании инкубации переложите сегмент в емкость с раствором для окрашивания Dapi, на две-пять минут на лед в темноте. Затем быстро закрепите ткань на предметном стекле для стеклянного микроскопа и накройте сегмент покровным стеклом.
Подтвердите флуоресценцию клеток эпидермиса под микроскопом, используя УФ-флуоресценцию. Затем установите образец в каплю промывочного буфера на новое предметное стекло микроскопа с новой стеклянной крышкой. Используя 20-кратное увеличение, верните сегмент в микроскоп и прокрутите образец, чтобы найти пролиферативные митотические фигуры.
Избегайте любого формообразующего деления клеток развивающихся стволовых мат, а затем определите, где находится наиболее дистальная митотическая фигура. С помощью программного обеспечения для анализа изображений измерьте полную длину кадра изображения. В данном примере 645 микрон.
Затем подсчитайте количество кадров, которые покрывают полную длину меристемы от самой дальней митотической фигуры до основания листа, и умножьте это число на длину одного кадра, чтобы получить полную длину меристемы. Чтобы получить профиль длины клетки, перенесите 11-сантиметровый сегмент из молочной кислоты на скамью и с помощью скальпеля разрежьте ткань на 10 односантиметровых сегментов. Закрепите полученные сегменты листа на одном предметном стекле микроскопа и добавьте небольшую каплю молочной кислоты.
Кладем все части одной стороной вверх. А затем перенесите предметное стекло под микроскоп, оснащенный дифференциальной интерференционно-контрастной оптикой. Начиная с сегмента, ближайшего к основанию листа, используйте соответствующую программу для анализа изображений для измерения длины по меньшей мере 20 реплицируемых эпидермальных клеток и файлов, непосредственно прилегающих к стволовым файлам, чтобы обеспечить последовательный выбор одного и того же типа клеток в равноудаленных друг от друга позициях вдоль каждого из сегментов.
Возьмите для того, чтобы зафиксировать соответствующее положение для каждого измерения по всему листу. Затем определим среднюю длину ячейки на каждом миллиметре по оси листа с помощью процедуры локального полиномиального сглаживания, реализованной в скрипте R, который доступен в виде дополнительного файла. Будьте осторожны, чтобы не переусердствовать.
Сглаживание должно устранять шум в данных celling, но не влиять на общую форму кривой. Здесь показано сравнение хорошо поливаемых растений и растений, подверженных стрессовым условиям засухи, с точки зрения роста их листьев. Конечная длина листьев контрольных растений была на 40 процентов ниже, чем у растений, подвергшихся стрессу от засухи, из-за более низкой скорости удлинения листьев.
Скорость удлинения листьев у растений, подвергшихся стрессу от засухи, на 73 процента ниже, чем у хорошо увлажненных растений, из-за снижения производства клеток. Что, в первую очередь, вызвано сниженной скоростью деления клеток. Кинематический анализ позволяет получить карту локализации зоны роста листьев, что позволяет осуществлять отбор проб с субзональным разрешением для молекулярного и биохимического анализа.
Например, количественное определение MDA вдоль зоны роста листа кукурузы у растений, подвергающихся хорошо орошаемому контролю и засушливым условиям, демонстрирует значительное увеличение этого продукта распада липидов по всей зоне роста в ответ на условия удержания воды. Из-за укорочения листьев в ответ на засуху зоны развития в этом эксперименте не совпадали в контроле и в растениях, испытывавших стресс. Однако, используя профиль длины клеток, можно определить длину зон развития, что позволяет сравнивать уровни MDA в отдельных зонах.
После освоения один образец может быть обработан за четыре часа, если техника выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что меристема должна оставаться нетронутой во время ее сбора. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как определение молекулярных и биохимических параметров, для изучения их участия в регуляции роста.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно измерять деление и расширение клеток при выращивании листьев кукурузы, определять размер различных зон роста и соответствующим образом интерпретировать молекулярные и биохимические данные. Не забывайте, что работа с молочной и уксусной кислотами, а также ЭДТА может быть опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и очистка микроскопа на каждом этапе после использования.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол количественной оценки деления и растяжения клеток в листьях кукурузы, что имеет решающее значение для понимания роста растения в целом. Этот подход позволяет изучать молекулярные механизмы регуляции роста с помощью стратегий отбора проб, специфичных для конкретных стадий развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития растений
- Механизмы клеточного роста
- Рост листьев кукурузы
Теоретическая часть
- Понимание процессов деления и растяжения клеток имеет жизненно важное значение для роста растений.
- В данном исследовании в качестве модельного организма используется кукуруза.
- Данный метод может быть применен и к другим видам злаков, а также к различным органам растений.
- Полученные результаты позволяют ответить на ключевые вопросы биологии развития.
Цель исследования
- Определить клеточную основу роста листьев кукурузы.
- Исследовать молекулярные механизмы регуляции роста.
- Реализовать стратегии отбора проб, специфичные для определенной стадии развития.
Используемые методы
- Количественная оценка деления и расширения клеток.
- Отбор проб в зависимости от стадии развития.
- Пространственное картирование биохимических и физиологических процессов.
- Применение метода к различным растительным системам.
Основные результаты
- Деление и растяжение клеток определяют различия в росте органов.
- Данный метод позволяет изучить механизмы роста.
- Метод применим к другим видам злаков и органам растений.
- Это способствует пониманию динамики роста всего растения.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание процессов роста листьев кукурузы.
- Метод может быть адаптирован для использования в других растительных системах.
- Полученные результаты вносят вклад в область биологии развития растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Кинематический анализ позволяет количественно оценить деление и расширение клеток для установления связи между молекулярными данными и определенными стадиями клеточного развития, что обеспечивает возможность направленного отбора проб в растительных системах. Такой подход способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска, проясняя, как клеточные процессы определяют фенотипическую изменчивость. Он предоставляет воспроизводимую основу для сопоставления биохимических измерений с зонами пространственного роста, что повышает прогностическую достоверность рабочих процессов валидации мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Количественная оценка вклада отдельных клеток в рост органа, что позволяет проверять гипотезы о механизмах регуляции роста.
- Операционная ценность: Определение длины меристемы и зон развития с помощью окрашивания DAPI и дифференциально-интерференционного контраста (DIC) для точного стадирования.
- Прогностическая ценность: Установление корреляции между молекулярными изменениями (например, уровнями MDA) и конкретными стадиями клеточного развития, что снижает неопределенность при определении мишеней воздействия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные профили длины клеток вдоль оси листа с помощью анализа изображений и локального полиномиального сглаживания.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный отбор эпидермальных клеток в равноотстоящих позициях для воспроизводимого фенотипического скрининга.
- Масштабируемость: время обработки одного образца после освоения метода составляет четыре часа, что подходит для приложений средней пропускной способности в исследовательской биологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Сопоставление зон развития позволяет проводить зонно-специфическое сравнение биохимических маркеров при различных условиях (например, при достаточном поливе по сравнению с засухой).
- Механистическое снижение рисков: Выявление клеточных факторов, определяющих различия в росте (например, снижение интенсивности деления клеток при засухе), для приоритизации мишеней.
- Прогностическая достоверность: Обеспечивает интерпретацию данных молекулярных анализов с высоким пространственным разрешением путем их привязки к валидированным стадиям развития клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Кинематический анализ применяется на ранних этапах поиска для обоснования идентификации ведущих соединений, обеспечивая клеточное разрешение фенотипов роста, особенно в моделях травянистых видов растений.
- Открывающая биология: Проверка гипотез о том, как деление и экспансия клеток влияют на различия в росте всего органа.
- Скрининг: Получение количественных, пространственно разрешенных измерений длины клеток для стандартизации оценки соединений или генотипов.
- Аналитика: Формирование профилей длины меристемы и длины клеток, позволяющих проводить статистическое сравнение условий роста.
- Трансляционные исследования: Связывание молекулярных биомаркеров (например, перекисного окисления липидов) с определенными зонами развития для обеспечения преемственности на этапах валидации.
- Корпоративное повторное использование: Создание воспроизводимого метода картирования зон роста, применимого для различных органов и систем однодольных растений.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Снижает неопределенность механизмов за счет количественной оценки клеточной основы роста, что повышает достоверность гипотез о мишенях.
- Операционная ценность: Стандартизирует определение стадий развития посредством профилирования длины меристемы и длины клеток, что повышает воспроизводимость результатов между лабораториями.
- Стратегическая ценность: Позволяет проводить целенаправленный отбор проб на конкретных стадиях для оптимизации использования ресурсов в молекулярных и биохимических исследованиях.
- Влияние на портфель проектов: Поддерживает обоснованное продвижение разработок с учетом рисков путем установления связи между клеточными фенотипами и молекулярными механизмами, что улучшает принятие решений о продолжении или прекращении проекта.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микроскопией (DIC, УФ-флуоресценция) и анализом изображений для измерения меристемы и длины клеток.
- Необходимо оборудование для срезания тканей, окрашивания (DAPI, молочная кислота) и контролируемого хранения (растворы этанола с уксусной кислотой, растворы молочной кислоты).
- Требуется стандартизация протоколов отбора проб между исследовательскими группами для обеспечения единообразного определения зон развития.
- При применении метода к системам, не относящимся к однодольным, или к органам с другими размерами зон роста, необходимо учитывать тканеспецифическую адаптацию.
- Согласно ограничениям протокола, метод применим только для выдвинутых листьев с зонами роста протяженностью в несколько сантиметров в период стационарного роста.
