Экспериментальный протокол для обнаружения Цианобактерии В жидких и твердых образцах с антителом Microarray Chip

Общей целью данной процедуры является определение наличия множественных штаммов цианобактерий в жидких и твердых образцах с помощью флуоресцентного микроматричного иммуноанализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области окружающей среды, мониторинга и управления водными ресурсами, такие как наличие токсинов, вырабатываемых бактериями, производящими протоксины, до того, как цветение станет видимым невооруженным глазом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что множественные штаммы цианобактерий и несколько образцов могут контролироваться одновременно в течение трех-четырех часов, как на месте, так и в лаборатории.

Таким образом, эти методы могут дать представление о биоразнообразии. Он также может быть применен в других областях, таких как мониторинг сельскохозяйственных установок, обнаружение жизни в напряженных средах или планетарные исследования. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, не будут испытывать трудностей.

Из-за простоты обработки образцов и облегчения интерпретации результатов. После выработки и очистки антител согласно текстовому протоколу добавьте 100 микролитров ДМСО в коммерческий флакон, содержащий краситель для мечения, один миллиграмм белка. После того, как краситель растворится, пометьте очищенные антитела, добавив два микролитра красителя к 50 микролитрам каждого препарата антител.

Реакции мечения выдерживают при температуре окружающей среды при непрерывном перемешивании на вибрационной платформе в течение одного часа. После очистки меченых антител в соответствии с текстовым протоколом загрузите небольшую аликвоту в спектрофотометр и измерьте поглощение на 280 и 650 нанометрах. Рассчитайте эффективность маркировки, следуя рекомендациям поставщиков.

Чтобы получить ЦИАНОЧИП, приготовьте 30 микролитров каждого очищенного антитела, смешав один миллиграмм на миллилитр антитела в 1X белковом печатном буфере с 01% объема на объем Tween 20. Приготовьте 30 микролитров следующих печатных растворов в качестве контрольных. 1X белковый печатный буфер с 01% объема на объем Tween 20.

Каждый белок А очищенная преиммунная сыворотка в дозе один миллиграмм на миллилитр в 1X белковом печатном буфере с 01% Tween 20 и 1 миллграмм на миллилитр BSA и 1X белковом печатном буфере с 01% Tween 20. Добавьте 30 микролитров на лунку приготовленных печатных растворов в высококачественные 384 луночных микропластины. После настройки печатного робота и подложек предметного стекла в соответствии с текстовым протоколом расположите все антитела и элементы управления на предметных стеклах в виде тройного пятна диаметром примерно от 180 до 200 микрон.

Для отбора проб в окружающей среде используйте стерильный шприц, чтобы собрать от одного до 100 миллилитров жидкости и сконцентрировать клетки, пропустив образец через фильтр размером пор в три микрона. При необходимости соберите твердые образцы из горных пород или почвы и храните их в стерильных пробирках. Образцы могут быть проанализированы в небольшой полевой лаборатории.

Добавьте один миллилитр экстракционного инкубационного буфера, чтобы восстановить биомассу, собранную в фильтре, и с помощью шпателя соскребите фильтр в 15-миллилитровую пробирку. С помощью ручного ультразвукового процессора или путем многократного пипетирования вверх и вниз этот образец агрегируется и гомогенизируется. Кроме того, взвесьте до 0,5 грамма твердого образца в отдельной пробирке объемом 10 миллилитров и добавьте до двух миллилитров экстракционного буфера.

Погрузите ультразвуковой щуп в трубку и произведите ультразвуковую обработку с помощью ручного ультразвукового процессора или другого ультразвукового устройства. Удерживая образец на льду, выполните не менее пяти 30-секундных циклов с частотой 30 килогерц, останавливаясь на 30 секунд между ультразвуковыми исследованиями. Чтобы приготовить экстракт фильтрата для иммунологического анализа, используйте шприц объемом 10 миллилитров, соединенный с нейлоновым фильтрующим держателем размером от пяти до 20 микрон, чтобы отфильтровать раствор в 1,5-миллилитровую трубку для удаления песка, глины и других крупных материалов.

Положив пятна микрочипа вниз, положите предметное стекло на каплю блокирующего раствора объемом от 100 до 200 микролитров и инкубируйте в течение трех-пяти минут. Используя щипцы с пластиковыми наконечниками, избегая зон микрочипа, осторожно поднимите предметное стекло. Погрузите предметное стекло в свежий раствор для блокировки и инкубируйте предметное стекло с легким перемешиванием в течение 30 минут.

Чтобы высушить предметное стекло, поместите его в центрифугу, приспособленную для предметных стекол микроскопа, и кратковременно покрутите. Установите предметное стекло в кассету для гибридизации микрочипов на три на восемь лунок, следуя инструкциям поставщика. В качестве альтернативы, после изменения шаблона печати антител, настройте индивидуальную кассету, такую как показанная здесь, или просто используйте для настройки предметные стекла.

После сборки предметного стекла и кассеты внесите пипетку до 50 микролитров экстракта каждого образца или его разведения в экстракционном инкубационном буфере в каждую лунку кассеты. В качестве альтернативы можно загрузить образцы в другие инкубационные устройства или просто использовать крышечные стекла. В качестве пустого контроля пипетку внесите 50 микролитров буфера TBSTRR по крайней мере в две отдельные лунки кассеты.

Инкубируйте образцы при температуре окружающей среды в течение одного часа и перемешивайте путем пипетирования каждые 15 минут или инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 12 часов. Чтобы промыть микрочипы, положите кассету вниз и осторожно постучите ее по чистой впитывающей бумаге. Затем промойте лунки, добавив в каждую из них по 150 микролитров инкубационного буфера для экстракции, и удалите буфер, постукивая по абсорбирующей бумаге, как и раньше.

Повторите стирку еще три раза. В каждую лунку добавьте 50 микролитров смеси флуоресцентных антител, содержащей 17 антител против цианобактериального штамма. Инкубируйте образцы при температуре окружающей среды в течение одного часа или при четырех градусах Цельсия в течение 12 часов.

Чтобы промыть микрочипы, осторожно опустите кассету вниз и аккуратно постучите ее по чистой впитывающей бумаге. Затем добавьте 150 микролитров экстракционного инкубационного буфера, прежде чем удалить его, постучав по бумажному полотенцу. Повторите стирку три раза.

Затем разберите кассету и погрузите предметное стекло в раствор 0,1X PBS для быстрого промывания. Быстро центрифугируете, как и раньше, чтобы высушить предметное стекло. С помощью флуоресцентного сканера отсканируйте предметное стекло на флуоресценцию на максимальном пике излучения для дальнего красного флуоресцентного красителя.

Сделайте несколько снимков микрочипов при разных параметрах сканирования, изменяя значение усиления. Наконец, загрузите сетку, количественно оцените, а затем обработайте и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. Мультиплексный иммуноферментный анализ CYANOCHIP, продемонстрированный в этом видео, был использован для одновременной идентификации наиболее значимых видов пресноводных цианобактерий, перечисленных в этой таблице.

Пробы воды, собранные на берегу пресноводного водоема, были проанализированы с помощью микрочипового анализа. Основные положительные иммунореакции соответствовали антителам к планктонным цианобактериям, видам microcystis и к бентосным видам лептолингбий. Более низкие флуоресцентные сигналы были получены для планктонных видов nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae и видов Benthic Rivularia.

Микрочип также был валидирован путем анализа антарктического сухого микробного мата для проверки на наличие маркеров цианобактерий. Положительные реакции в антителах продуцировались к бентосным цианобактериям, видам anabaena и лептолингбям. Дополнительные положительные иммунореакции были обнаружены при наличии антител к планктонным цианобактериям, таким как виды microcystis, виды aphanizomenon и виды planktothrix rubescens.

Наконец, эти сигналы были получены от антител к другим бентическим видам, включая виды tolypothrix и anabaena. После освоения эту методику можно сделать за три, четыре часа, если ее правильно выполнить, исключив выработку антител и выравнивание. За счет одновременной инкубации образца и флуоресцентных антител можно сэкономить один час.

При выполнении этих процедур важно помнить о том, что смесь флуоресцентных антител должна быть готова вместе с антителами в оптимальном рабочем разведении. После этих процедур могут быть выполнены другие методы, такие как оптическая микроскопия или экстракция ДНК и специфическая ПЦР-амплификация, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как концентрация в почве или подтвердить тип обнаруженного штамма. После своего развития эта методика откроет путь исследователям в области мониторинга окружающей среды к исследованию водных объектов, бикультурных процессов, управления пресной водой или исследований микробной экологии, независимо от типа образца.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как мечить антитела флуоресценцией, манипулировать микрочипами антител, выполнять мультиплексный иммуноферментный анализ, а также анализировать и интерпретировать результаты иммуноферментного анализа микрочипов. Не забывайте, что работа с ультразвуком может быть опасной, и при выполнении этих процедур всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение средств защиты органов слуха или другие специфические меры ухода.