Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

Основная цель метода, представленного в данной видеостатье, заключается в быстром создании пространственно определенных клеточных паттернов для облегчения анализа межклеточных взаимодействий in-situ в пространственно-временном аспекте. Предложенная стратегия основана на использовании технологии микрофлюидного зонда. Микроизготовленная головка зонда локализует нанолитровые объемы биохимических веществ на биологических подложках для формирования паттернов клеточных монослоев.

Основным преимуществом метода структурирования на основе MFP является практически мгновенный результат благодаря локальному лизису, что позволяет в режиме реального времени модифицировать создаваемые паттерны. Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили, что другие способы формирования клеточных паттернов требуют длительных многоэтапных протоколов, прежде чем станет виден конечный результат. Для проведения стабильных экспериментов с гидродинамическим ограничением потока на поверхности клеток необходимо оптимизировать параметры MFP.

Для этой цели крайне важна визуальная демонстрация. Адитья Кашьяп и Жюльен Корс продемонстрируют данную процедуру. Операционные модули платформы состоят из моторизованных шприцев, моторизованных столиков и контроллера.

MFP подключен к моторизованному Z-столику для управления зазором между головкой и подложкой, а держатель подложки прикреплен к моторизованным X- и Y-столикам, образующим систему сканирования. Головка MFP имеет жидкостные каналы для подключения к насосной станции, монтажные отверстия для крепления головки к Z-столику и каналы, выходящие через полированную вершину. Вершина установлена в одной плоскости с подложкой для культивирования клеток.

Для подготовки насосной станции и аппарата для подачи жидкости перед проведением экспериментов с живыми клетками и после них очистите шприцы и поршни шприцев с помощью соникации и 0,5% раствора гипохлорита натрия в ультрачистой воде. Тщательно промойте их водой. Заполните шприцы водой, полностью погрузив их наконечники в водяную баню и втянув жидкость с помощью поршня.

Прокачайте жидкость, находясь в водяной бане, прижимая стержень шприца к уплотнителю на выходе из шприца. Продолжайте аспирировать и прокачивать жидкость до тех пор, пока в колонках шприца не исчезнут пузырьки воздуха. Подключите заполненные шприцы к шприцевым насосам, используя коннекторы с нижним фиксатором.

Используйте переключающий клапан, установленный на насосах, чтобы направить жидкость из шприца в один из двух капилляров, ведущих либо к головке MFP, либо к резервуарам с жидкостью. Промойте оба капилляра водой из шприцев при скорости потока примерно от 10 до 50 µL в минуту, в зависимости от размера шприца, пока в шприцах не останется около 10 µL воды. Очистите головку MFP методом соникации, используя моющее средство для лабораторной посуды для стандартной очистки или 0,5% раствор гипохлорита натрия для тщательной очистки, в течение пяти минут.

Промойте каналы водой, погрузив верхушку в воду и создав вакуум в отверстиях. Осмотрите каналы под стереомикроскопом на предмет возможных засоров и, при необходимости, повторите предыдущий шаг. Затем установите очищенную головку в держатель и прикрутите коннектор к головке.

Вставьте продутые капилляры в соответствующий адаптер микрофлюидного коннектора, который сопрягается с каналами в головке. Прикрутите держатель головки к Z-столику, используемому для контроля расстояния зазора между головкой и монослоем клеток, перед выполнением калибровки конечной точки, как описано в текстовом протоколе. Получите приблизительное нулевое расстояние зазора, переместив головку MFP над предметным стеклом с камерой без клеток и медленно опуская ее с шагом в 5 мкм.

При контакте зонда с подложкой должны наблюдаться кольца Ньютона. Это является предварительной оценкой. Точное положение определяется после регулировки копланарности вершины зонда относительно подложки.

После появления колец Ньютона убедитесь, что они симметричны. Для обеспечения копланарности вершины зонда отрегулируйте наклон головки с помощью гониометра, расположенного на интерфейсе между головкой и Z-кареткой. Отодвиньте головку MFP на 20 microns от подложки и отрегулируйте наклон с помощью гониометра.

Повторяйте опускание, обнуление и регулировку наклона до тех пор, пока кольца Ньютона при контакте не станут симметричными. После регулировки наклона установите в качестве нуля положение по оси Z, при котором кольца Ньютона симметричны. Затем подготовьте обрабатывающую жидкость для внутреннего инжекционного канала и буферный раствор для экстракции, необходимый для внешней инъекции, как описано в текстовом протоколе.

Используя сливную линию, подключенную к шприцевым насосам, удалите оставшуюся воду и аспирируйте дегазированные растворы в инъекционные шприцы со скоростью 40 µL в минуту, пока шприцы не будут заполнены. Это обеспечит заполнение шприцев, коннекторов и капилляров без образования пузырьков. Для подготовки монослоев клеток на предметных стеклах с камерой вырастите клетки в Т-флаконах, используя стандартные протоколы культивирования клеток.

При достижении клетками конфлюэнтности в культуральных колбах проведите трипсинизацию и соберите клетки. Высейте 0,2 миллиона клеток на квадратный сантиметр в каждую из двухкамерных предметных стекол для создания паттернов. Культивируйте клетки в течение 48 часов, используя клетки в одной из камер в качестве контроля роста и жизнеспособности клеток.

После достижения клетками конфлюэнтности на предметных стеклах с камерами инкубируйте их в течение 45 минут с 500 microliters раствора красителя CellTracker в концентрации 10 micromolar, приготовленного в безсывороточной среде. Это необходимо для визуализации клеток в процессе формирования паттернов. Промойте маркированные клетки раствором PBS, аккуратно промывая каждую камеру с помощью пипетки.

Затем культивируйте клетки в среде с добавлением сыворотки для экспериментов по созданию паттернов. Гидродинамический поток ограничивает перемещение жидкостей за счет одновременного введения и аспирации рабочей жидкости. При иерархическом ограничении локализуются несколько рабочих жидкостей, при этом внешнее HFC экранирует образец от внутреннего HFC, используемого для обработки.

Переместите MFP над монослоем клеток до зазора в 50 мкм от предметного стекла. Такой размер зазора обеспечивает контакт иерархического HFC, а также учитывает вариации поверхности и толщины монослоя. Вводите гидроксид натрия со скоростью шесть или восемь мкл/мин через I-two.

Оцените другие скорости потока, следуя правилам регулирования потока, описанным в текстовом протоколе. Регулируйте размер внутреннего HFC, изменяя соотношение скоростей инъекции QI-two и QI-one с помощью инъекционных шприцев. Например, используйте значение QI-one от 1.3 µL/min до 4 µL/min при фиксированном значении QI-two на уровне 8 µL/min, чтобы получить область воздействия гидроксида натрия размером от 150 до 300 клеток.

Вводите полную среду через самые внешние отверстия головки MFP со скоростью потока 20 microliters per minute, чтобы компенсировать испарение среды и аспирацию во время работы hHFC. Для создания рисунка из монослоев клеток настройте программное обеспечение предметного столика так, чтобы головка зонда сканировала монослой клеток по заданным пользователем траекториям со скоростью сканирования 10 microns per second и зазором 50 microns. При работающем и контактирующем с монослоем вложенном hHFC перемещайте MFP по траектории желаемого рисунка для селективного удаления клеток.

Для кокультуры после удаления первого типа клеток, как и ранее, высейте другую клеточную линию, чтобы заполнить пустоты. Подготовьте станцию отбора проб для последующего анализа лизата. Здесь приведен пример станции отбора проб, которая состоит из напечатанного на 3D-принтере держателя для восьмиполосных ПЦР-планшетов.

Протрите держатель пробирок 70% этанолом или другими средствами для дезинфекции поверхностей, в зависимости от требуемой степени чистоты для данного применения. Используйте магнитный зажим на держателе пробирок, чтобы закрепить его на держателе подложки. После подготовки станции отбора проб расположите головку MFP на расстоянии 100 микрон от монослоя.

Начните работу с hHFC, используя 50 мМ раствор гидроксида натрия в качестве рабочей жидкости для внутреннего инжекционного канала со скоростью потока 1 µL/min для QI-one, 6 µL/min для QI-two, -7 µL/min для QA-one и -17,5 µL/min для QA-two. После стабилизации удержания потока опустите головку зонда до зазора 50 мкм, чтобы провести локальный лизис выбранной субпопуляции клеток с помощью hHFC с использованием гидроксида натрия. По завершении лизиса субпопуляции переместите головку к пробиркам в станции отбора проб.

Выдавите собранный лизат непосредственно в ПЦР-пробирки. После обработки лизата, согласно текстовому протоколу, введите его в стандартный рабочий процесс qPCR в соответствии с инструкциями поставщика прибора. Путем контроля соотношения нагнетаемых жидкостей в иерархическом HFC модулируется размер области контакта с поверхностью клетки.

Скорость потока была выбрана таким образом, чтобы основным механизмом лизиса клеток был химический эффект, а не сдвиговое напряжение. Это было подтверждено путем определения сдвига с помощью методов вычислительной гидродинамики. Здесь показано создание сетки клеточных островков путем программирования траектории сканирования с помощью MFP.

Модуляция размера отпечатка с помощью соотношения инъекционной жидкости позволяет контролировать разрешение удаления клеток. Этот метод может быть использован для последовательного совместного культивирования нескольких популяций клеток, что позволяет создавать сложные паттерны межклеточных взаимодействий. Использование гидроксида натрия в качестве обрабатывающей жидкости делает лизат пригодным для анализа клеток методом ПЦР.

В данном случае было количественно определено содержание ДНК из одного и пяти отпечатков, лизированных с использованием описанного метода. После освоения эта техника может быть выполнена на клетках менее чем за 30 минут. При выполнении этой процедуры важно убедиться, что в каналах и капиллярах нет пузырьков воздуха, так как это может отрицательно повлиять на HFC.

Не забывайте, что работа с гидроксидом натрия, который является коррозионно-активным химическим раствором, может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, используя защитные очки и лабораторные халаты. После проведения этой процедуры можно проводить локальный анализ клеток с помощью иммуноокрашивания или секвенирования ДНК-РНК посредством лизиса, опосредованного MFP, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, какие белки гиперэкспрессированы вследствие геометрического ограничения клеток. После своей разработки данный метод может открыть исследователям в области молекулярной биологии путь к изучению межклеточного и внеклеточного сигналинга в процессе генерации и дегенерации тканей.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять субтрактивное структурирование монослоев клеток, созданных в MFP для локальной обработки, и создавать сложные геометрические структуры кокультур клеток.