Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

Основная цель метода, представленного в этой видеостатье, заключается в быстром создании пространственно определенных клеточных структур для облегчения пространственно-временного анализа межклеточных взаимодействий in situ. В представленной стратегии используется технология микрофлюидных зондов. Микроизготовленная зондовая головка локализует нанолитровые объемы биохимических веществ на биологических субстратах для моделирования монослоев клеток.

Основное преимущество метода структурирования на основе МФУ заключается в том, что он происходит практически мгновенно благодаря локальному лизису, что позволяет создавать шаблоны в режиме реального времени. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что другие методы создания клеточных шаблонов требуют длительных, многоступенчатых протоколов, прежде чем мы действительно увидим успех клеточных шаблонов. Для проведения стабильных экспериментов с удержанием гидродинамического потока на поверхности ячейки необходимо оптимизировать параметры МФУ.

Для этой цели решающее значение имеет визуальная демонстрация. Адитья Кашьяп и Жюльен Корс продемонстрируют эту процедуру. Операционные модули платформы состоят из моторизованных шприцев, моторизованных ступеней и контроллера.

МФУ подключено к моторизованному Z-столику для контроля расстояния между головкой и подложкой, а держатель подложки прикреплен к моторизованным столикам X и Y, составляющим сканирующую систему. Головка МФУ имеет переходные отверстия для подключения к насосной станции, монтажные отверстия для установки головки на Z-ступень и каналы, выходящие из полированной вершины. Вершина расположена компланарно субстрату клеточной культуры.

Для подготовки насосной станции и устройства для работы с жидкостями очистите шприцы и поршни шприцев ультразвуком и 0,5%-ным раствором отбеливателя в сверхчистой воде до и после экспериментов с живыми клетками. Тщательно промойте их водой. Наполните шприцы водой, полностью погрузив их кончики в водяную баню и аспирировав с помощью поршня.

Продуйте жидкость, находясь в водяной бане, при этом стержень шприца соприкасается с уплотнением на выходе из шприца. Продолжайте отсасывать и продувать до тех пор, пока в колонках шприца не исчезнут пузырьки воздуха. Подсоедините заполненные шприцы к шприцевым насосам с помощью разъемов с нижним замком.

Используйте переключающий клапан, установленный на насосах, чтобы направить жидкость из шприца в один из двух капилляров, ведущих либо к головке МФУ, либо к резервуарам с жидкостью. Продуйте оба капилляра водой из шприцев со скоростью потока от 10 до 50 микролитров в минуту, в зависимости от размера шприца, пока в шприцах не останется около 10 микролитров воды. Очистите головку МФУ с помощью ультразвука с использованием моющего средства для стеклянной посуды для стандартной очистки или 0,5% отбеливателя для строгой очистки в течение пяти минут.

Продуйте каналы водой, погрузив верхушку в воду и подав вакуум на переходные отверстия. Осмотрите каналы под стереомикроскопом на предмет возможных препятствий и при необходимости повторите предыдущий шаг. Далее установите очищенную головку на держатель головки и накрутите разъем на головку.

Вставьте продутые капилляры в соответствующий адаптер микрофлюидного соединителя, который сопрягается с переходными отверстиями канала в головке. Прикрутите держатель головки к Z-ступени, которая используется для контроля расстояния между головкой и монослоем ячейки, перед выполнением калибровки конечной точки, как описано в текстовом протоколе. Получите грубое расстояние с нулевым зазором, наведя головку МФУ на предметное стекло камеры без ячеек и медленно опускаясь с шагом в пять микрон.

При контакте зонда с подложкой следует наблюдать за кольцами Ньютона. Это приблизительная оценка. Точное положение должно быть получено после регулировки компланарности вершины зонда к подложке.

После формирования убедитесь, что кольца Ньютона симметричны. Чтобы обеспечить компланарность вершины зонда, отрегулируйте наклон головки с помощью угломера на границе головки и Z-ступени. Переместите головку МФУ на 20 мкм от подложки и отрегулируйте наклон с помощью угломера.

Повторяйте спуск, пристрелку и регулировку наклона до тех пор, пока кольца Ньютона не станут симметричными при контакте. Отрегулировав наклон, установите положение Z, при котором получаются симметричные кольца Ньютона, на ноль. Затем подготовьте технологическую жидкость для внутреннего канала впрыска и буферный раствор для экстракции, необходимый для внешнего впрыска, как описано в текстовом протоколе.

С помощью дренажной магистрали подсоединить к шприцевым насосам, продуть оставшуюся воду и отсасывать дегазированные растворы в инъекционные шприцы со скоростью 40 микролитров в минуту до тех пор, пока шприцы не будут заполнены. Это обеспечивает заполнение шприцев, коннекторов и капилляров без пузырьков. Для получения монослоев клеток на предметных стеклах камер проводят в Т-образных колбах с использованием стандартных протоколов культивирования клеток.

По достижении слияния клеток в культуральных колбах трипсинизируют и собирают клетки. Засейте 0,2 миллиона клеток на квадратный сантиметр в каждом из двухкамерных слайдов для построения узора. Культивируйте клетки в течение 48 часов, используя клетки в одной из камер в качестве контроля роста и жизнеспособности клеток.

По достижении слияния клеток на предметных стеклах камеры инкубируйте клетки в течение 45 минут с 500 микролитрами раствора красителя Cell-Tracker в концентрации 10 микрометров, приготовленным в бессывороточной среде. Это делается для визуализации клеток во время построения паттерна. Промойте помеченные ячейки PBS, аккуратно промыв каждую камеру с помощью пипетки.

Затем культивируют клетки в среде с добавлением сыворотки для экспериментов по структурированию. Гидродинамическое удержание потока локализует жидкости с помощью одновременного впрыска и аспирации технологической жидкости. В иерархическом конфайнменте несколько технологических жидкостей ограничены, при этом внешний ГФУ защищает образец от внутреннего технологического ГФУ.

Переместите МФУ над монослоем ячейки на расстояние 50 мкм от предметного стекла. Это расстояние зазора обеспечивает контакт иерархической ГФУ, а также учитывает изменение поверхности и толщины монослоя. Впрыскивание гидроксида натрия со скоростью шесть или восемь микролитров в минуту через I-two.

Оценивайте другие скорости потока с помощью правил потока в текстовом протоколе. Модулируйте размер внутреннего ГФУ путем изменения соотношения скоростей впрыска QI-two и QI-one с помощью инъекционных шприцев. Например, используйте QI-единицу в диапазоне от 1,3 микролитра в минуту до четырех микролитров в минуту, при этом QI-2 должна быть зафиксирована на уровне восьми микролитров в минуту, чтобы получить след гидроксида натрия от 150 до 300 клеток.

Впрыскивание всей среды из крайних отверстий на головке МФУ со скоростью потока 20 микролитров в минуту для учета испарения среды и аспирации во время работы hHFC. Чтобы смоделировать монослои ячейки, настройте программное обеспечение рабочей области на сканирование головки зонда над монослоем ячейки в заданных пользователем шаблонах со скоростью сканирования 10 микрон в секунду и расстоянием зазора 50 микрон. Когда вложенный hHFC работает и находится в контакте с монослоем, отсканируйте МФУ по траектории желаемого шаблона, чтобы добиться удаления шаблонных клеток.

Для кокультуры после удаления первого типа клеток засейте другую клеточную линию, чтобы заполнить пробелы, как и раньше. Подготовьте станцию отбора проб для последующего анализа лизата. Здесь показан пример станции для отбора проб, которая включает в себя напечатанный на трех D-принтерах восьмиполосковый держатель для ПЦР.

Протрите держатель тюбика 70% этанолом или другими поверхностными обеззараживающими веществами в зависимости от требуемой для применения строгости. С помощью магнитного зажима на держателе пробирки прикрепите его к держателю подложки. После подготовки станции отбора проб расположите головку МФУ на расстоянии 100 мкм от монослоя.

Начните работу с hHFC с 50 миллимолярным раствором гидроксида натрия в качестве технологической жидкости для внутреннего канала впрыска со скоростью потока один микролитр в минуту для QI-один, шесть микролитров в минуту для QI-2, минус семь микролитров в минуту для QA-1 и минус 17,5 микролитров в минуту для QA-2. После того как удержание потока стабилизируется, опустите головку зонда на расстояние 50 микрон, чтобы выполнить локальный лизис на основе гидроксида натрия в выбранной субпопуляции клеток с hHFC. После завершения лизиса субпопуляции направьте голову к пробиркам на станции отбора проб.

Вытолкните собранный лизат непосредственно в ПЦР-пробирки. После обработки лизата, как описано в текстовом протоколе, загрузите лизат в стандартный рабочий процесс количественной ПЦР, установленный поставщиком прибора. За счет регулирования соотношения инжекционных жидкостей в иерархическом ГФУ модулируется размер следа, контактирующего с поверхностью клетки.

Скорость потока была выбрана таким образом, чтобы доминирующим механизмом лизиса клеток был химический эффект, а не сдвиг. Это было подтверждено определением сдвига с помощью вычислительной гидродинамики. Здесь показано создание сетки островков сотовых клеток путем программирования траектории сканирования с помощью МФУ.

Модуляция размера занимаемой площади с помощью соотношения жидкости для впрыска позволяет контролировать разрешение удаления ячеек. Этот метод может быть использован для последовательной кокультуры нескольких клеточных популяций, тем самым создавая сложные паттерны межклеточных взаимодействий. Использование гидроксида натрия в качестве технологической жидкости делает лизат совместимым с анализом клеток на основе ПЦР.

Здесь содержание ДНК было количественно определено по пяти и одному следу, лизированному с использованием описанного метода. После освоения эта техника может быть выполнена на клетках менее чем за 30 минут. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что каналы и капилляры свободны от пузырьков воздуха, так как это может негативно повлиять на ГФУ.

Не забывайте, что работа с гидроксидом натрия, коррозионным химическим раствором, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защитные очки и лабораторные халаты. Следуя этой процедуре, мы можем локально анализировать клетки с помощью иммуноокрашивания или секвенирования ДНК-РНК с помощью MFP-опосредованного лизиса, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие белки чрезмерно экспрессируются из-за геометрического удержания клеток. После своего развития этот метод может проложить путь исследователям в области молекулярной биологии к изучению меж- и внеклеточной сигнализации во время генерации и дегенерации тканей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как субтрактивно моделировать монослои клеток, настроенных в МФУ, для локальной обработки и создавать сложные геометрии сокультур клеток.