Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

Общая цель этой экспериментальной процедуры заключается в картировании пространственно-временной динамики экспрессии генов часов сегментации позвоночных с использованием фиксированного образца тканей. Этот метод позволяет непредвзято оценить динамику осцилляторных генов в пресомитной мезодерме, и это имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов, управляющих соматогенезом позвоночных. Основное преимущество этого метода заключается в том, что многие образцы могут быть сгенерированы и обработаны одновременно, что позволяет проводить трехкомпонентный анализ динамики экспрессии генов в фиксированной ткани.

Демонстрировать процедуру будет доктор Шарлотта Бейли, которая в прошлом работала постдоком в моей лаборатории. После получения мышиного маточного рога согласно текстовому протоколу, под стереомикроскопом, с помощью изогнутых ножниц разрезают толстую мышечную оболочку маточного рога и аккуратно извлекают каждый эмбрион. С помощью изогнутых ножниц и тонких щипцов отрежьте амниотический мешок от каждого эмбриона.

Затем с помощью хирургической иглы или изогнутых ножниц соберите ткань хвоста у каждого эмбриона, разрезая зачатки конечностей от передних до задних. Отбалансируйте хвостовую ткань вентральной стороной вниз. Затем сгенерируйте пары эксплантов ПСМ, рассекая ткань хвоста на две половины по средней линии, используя легкие покачивающие движения иглой.

Убедитесь, что нервная трубка, хорда и ткань ПСМ поровну разделены между двумя эксплантами. Затем пипеткой наведите каждый контралатеральный эксплант ПСМ на нижнюю сторону 35-миллиметровой пластиковой крышки чашки для культуры в небольшом объеме предварительно подогретой питательной среды. Поставьте блюдо на верхнюю часть крышки и быстро переверните ее, чтобы салфетка ПСМ была подвешена к крышке в висящей капле среды.

Затем культивируют ПСМ в увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Перенесите пары эксплантов ПСМ в отдельные лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей. Затем добавьте в образцы 4% параформальдегида из PBS и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа, или при четырех градусах Цельсия на качающейся платформе на ночь.

После инкубации используйте PBS для промывки лунок для образцов при комнатной температуре на качающейся платформе. С помощью тонкой пластиковой пипетки Пастера замените раствор PBS на образцах три-четыре раза. Для проведения иммуногистохимии добавьте 2% Triton X-100 в PBS к одному экспланту PSM от каждой эмбриональной пары и инкубируйте образцы при комнатной температуре на качающейся платформе в течение одного часа для их промывания.

Используйте PBS для краткого промывания образцов. Затем замените PBS на блокирующий раствор и инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия на качающейся платформе в течение ночи. Используя рабочий буфер, развести нужные первичные антитела.

В этом примере антитела к дельта-подобным 1 и Notch1 используют в разведении 1:25. Добавьте антитела к эксплантам и инкубируйте образцы на качающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-пяти дней. После инкубации используйте PBS для промывки образцов два раза по пять-десять минут каждый.

Затем выполните три промывки в 0,3%Triton X-100 в PBS при комнатной температуре на качающейся платформе. После разведения вторичных антител в рабочем буфере добавьте 250-500 микролитров раствора антитела в каждую лунку, стараясь не использовать последние несколько микролитров раствора, которые могут содержать агрегаты антител. Оловянной фольгой накройте планшет и инкубируйте образцы во вторичном растворе антител в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-пяти дней.

После инкубации используйте PBST для промывания образцов дважды по десять минут каждый. Затем с помощью PBS простирайте салфетку один раз при комнатной температуре на качающейся платформе в течение пяти минут. Следуя текстовому протоколу, обезвоживайте и регидратируйте оставшиеся контралатеральные экспланты PSM с помощью серии разведения этанола PBST.

Добавьте десять микрограммов на миллилитр протеиназы К в 0,1% PBST к эксплантам и инкубируйте ткань без перемешивания в течение пяти минут. Затем быстро удалите раствор протеиназы К и с помощью PBST кратко промойте образцы. Добавьте 4% формальдегида и 0,1% глутарового альдегида в PBST в экспланты PSM, чтобы закрепить их, и инкубировать образцы в течение 30 минут.

Затем, после использования PBST для промывки образцов дважды по десять минут каждый, добавьте в ткань 50% гибридизационную смесь и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия без перемешивания в течение десяти минут. После инкубации образцов и гибридизационной смеси в соответствии с текстовым протоколом удалите раствор и добавьте от 0,25 до 0,5 мл предварительно подогретой гибридизационной смеси, содержащей меченный дигоксигенином антисмысловой РНК-зонд против известного компонента часов сегментации. Используйте липкую ленту, чтобы запечатать планшет, и инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух ночей.

После инкубации используйте предварительно подогретую 50%-ную смесь для гибридизации в TBST для промывания образцов в течение 15 минут. Затем используйте TBST для двукратной промывки образцов перед инкубацией ткани в TBST при комнатной температуре на качающейся платформе в течение 30 минут. Затем предварительно инкубируйте экспланты в блокирующем растворе в течение как минимум двух часов.

Затем замените раствор свежим блокирующим раствором, содержащим разведение 1:200 конъюгированного антидигоксигенинового антитела HRB. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день с помощью TBST трижды промыть образцы при комнатной температуре и перенести их в отдельные лунки нового 24-луночного планшета для культивирования тканей.

Затем с помощью TBST промойте экспланты три раза по одному часу каждый. Используйте набор для усиления сигнала тирамида для визуализации обнаруженной мРНК перед подготовкой образцов к визуализации. Подготовьте по одному заряженному адгезионному предметному стеклу для каждой пары экспланта, сняв адгезивный вкладыш с распорки для визуализации толщиной 0,12 мм и наклеив его на предметное стекло.

После размещения пары или эксплантов на предметном стекле в соответствии с текстовым протоколом дайте образцам прилипнуть к предметному стеклу в течение 45-60 секунд, пока ткань не начнет казаться липкой и полупрозрачной без полного высыхания. Тем временем с помощью щипцов удалите остатки клейкого вкладыша из спейсера и добавьте большую каплю двухфункциональной монтажной среды и очищающего раствора в образцы в центре спейсера. Нанесите на образцы круговую защитную накладку, следя за тем, чтобы монтажная среда была равномерно распределена и все края соприкасались с распоркой.

Затем положите покровную горку вверх дном на бумагу с низким ворсом. Сильно прижмите, чтобы убедиться, что покровное стекло полностью прилегает к распорке и что излишки монтажной среды удалены. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока монтажная среда больше не промокнет бумагу.

Очистите предметное стекло и наклейте на него этикетку и храните его в темноте до создания изображения. Затем провести визуализацию и анализ согласно текстовому протоколу. В этом эксперименте показано, что экспрессия белков Delta-Like 1 и Notch1 колеблется вне синхронности при временном расположении эмбрионов в соответствии с зарождающейся транскрипцией гена часов регулируемой сегментации Notch intronic lunatic fringe, обнаруженной в одной половине каждой пары эксплантов.

Панели расположены в соответствии с первой, второй и третьей фазами тактового цикла сегментации. Протяженность доменов экспрессии для дельта-подобных 1, Notch1 и интронной лунатической каймы вдоль переднезадней оси ПСМ обозначена полосами с цветовой кодировкой. Как показано на рисунке, строится график для количественной оценки интенсивности сигнала Delta-Like 1, Notch1 и интронной лунатической полосы по отношению к переднезадней оси ПСМ, а также иллюстрируется изменение оси и интенсивность сигнала по всей ПСМ на протяжении всего тактового цикла.

Кимографы визуализируют пространственное распределение дельта-подобных 1, Notch1 и интронных безумных полос на многочисленных PSM. Каждая строка кимографа представляет интенсивность сигнала отдельного экспланта PSM. Количественная оценка интенсивности сигнала Delta-Like 1, Notch1 и intronic lunatic fringe по отношению к переднезадней оси PSM показывает четкую динамику колебательной экспрессии для этих мишеней.

Наконец, эти кимографы показывают пространственное распределение расщепленной и активированной формы рецептора Notch NICD, Delta-Like 1, интронной лунатической каймы и Notch1 по многочисленным PSM. Этот метод помог исследователям в области митогенеза позвоночных лучше понять динамику колебаний генов сегментации в пресомитной мезодерме цыплят и мышей. После освоения этот метод может быть выполнен на большом количестве образцов, что позволяет одновременно анализировать профили экспрессии нескольких мРНК и белков, представляющих интерес

После этой процедуры дополнительная количественная оценка данных изображения может обеспечить понимание временных задержек в экспрессии генов, а также субклеточной локализации как РНК, так и белковых сигналов, представляющих интерес для исследователя. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как составить карту пространственно-временной динамики экспрессии генов часов сегментации позвоночных с помощью забора толстых тканей. За этим может последовать автоматический анализ изображений, как подробно описано в текстовом протоколе.

При проведении этой процедуры важно обеспечить равномерное распределение ПСМ, хорды и нервной трубки между эксплантами ПСМ, а также тщательно оптимизировать разведение антител перед началом. Помните, что работа с формамидом, параформальдегидом и глутаральдегидом может быть чрезвычайно опасной. Будьте осторожны, надевайте средства индивидуальной защиты и работайте в вытяжном шкафу, где это возможно.