Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в картировании пространственно-временной динамики экспрессии генов сегментационного часы позвоночных с использованием отбора проб фиксированных тканей. Этот метод позволяет провести объективную оценку осцилляторной динамики генов в пресомитной мезодерме, что имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов, управляющих соматогенезом позвоночных. Основным преимуществом данной методики является возможность одновременного получения и обработки большого количества образцов, что позволяет проводить детальный трехэтапный анализ динамики экспрессии генов в фиксированной ткани.

Процедуру продемонстрирует доктор Шарлотта Бейли, бывший постдок в моей лаборатории. После получения рога матки мыши согласно текстовому протоколу, используя стереомикроскоп и изогнутые ножницы, разрежьте толстую мышечную оболочку рога матки и осторожно извлеките каждый эмбрион. С помощью изогнутых ножниц и тонкого пинцета отделите амниотический мешок от каждого эмбриона.

Затем, используя хирургическую иглу или изогнутые ножницы, выделите ткань хвоста каждого эмбриона, произведя разрез спереди от зачатков задних конечностей. Положите ткань хвоста брюшной стороной вниз. После этого создайте пары эксплантатов PSM, разделив ткань хвоста на две половины по срединной линии, аккуратно покачивая иглу.

Убедитесь, что нервная трубка, хорда и ткань PSM разделены поровну между двумя эксплантами. Затем перенесите каждый контралатеральный эксплант PSM пипеткой на внутреннюю сторону крышки пластического культурального чана диаметром 35 мм в небольшом объеме предварительно подогретой культуральной среды. Поместите чан на крышку и быстро переверните его так, чтобы ткань PSM была подвешена к крышке в виде висячей капли среды.

Затем культивируйте эксплантаты PSM в увлажненной камере при 37 °C в течение одного-двух часов. Перенесите пары эксплантатов PSM в отдельные лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей. Затем добавьте к образцам 4% параформальдегид в PBS и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа или при 4 °C на качалке в течение ночи.

После инкубации промойте лунки с образцами в PBS при комнатной температуре на качалке. С помощью тонкой пластиковой пипетки Пастера замените раствор PBS в образцах три-четыре раза. Для проведения иммуногистохимического анализа добавьте 2% Triton X-100 в PBS в один эксплантат PSM из каждой эмбриональной пары и инкубируйте образцы при комнатной температуре на качалке в течение одного часа для промывки.

Кратковременно промойте образцы с помощью PBS. Затем замените PBS блокирующим раствором и инкубируйте образцы при температуре four degrees Celsius на качалке в течение ночи. Разведите необходимые первичные антитела, используя рабочий буфер.

В данном примере антитела к Delta-like 1 и Notch1 используют в разведении 1:25. Добавьте антитела к эксплантам и инкубируйте образцы на качалке при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-пяти дней. После инкубации промойте образцы PBS дважды по пять-десять минут каждый раз.

Затем проведите три промывки в 0,3% растворе Triton X-100 в PBS при комнатной температуре на качалке. После разведения вторичных антител в рабочем буфере добавьте 250-500 µL раствора антител в каждую лунку с образцом, стараясь не использовать последние несколько µL раствора, которые могут содержать агрегаты антител. Накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте образцы в растворе вторичных антител в темноте при 4 °C в течение трех-пяти дней.

После инкубации дважды промойте образцы раствором PBST по десять минут каждый раз. Затем однократно промойте ткань в PBS при комнатной температуре на качалке в течение пяти минут. Следуя текстовому протоколу, проведите дегидратацию и регидратацию оставшихся эксплантатов контралатерального PSM через серию разведений этанола в PBST.

Добавьте в эксплантаты протеиназу K в концентрации 10 µg/mL в 0,1% PBST и инкубируйте ткань без перемешивания в течение пяти минут. Затем быстро удалите раствор протеиназы K и кратко промойте образцы PBST. Добавьте к эксплантатам PSM 4% формальдегид и 0,1% глутаральдегид в PBST для дофиксации и инкубируйте образцы в течение 30 минут.

Затем, после двукратной промывки образцов в PBST по десять минут каждый раз, нанесите на ткань 50% гибридизационной смеси и инкубируйте при 65 °C без перемешивания в течение десяти минут. После инкубации образцов с гибридизационной смесью согласно текстовому протоколу удалите раствор и добавьте от 0,25 до 0,5 мл предварительно нагретой гибридизационной смеси, содержащей антисмысловой РНК-зонд, меченный дигоксигенином, против известного компонента сегментационного clock. Заклейте планшет липкой лентой и инкубируйте образцы при 65 °C в течение двух ночей.

После инкубации промойте образцы в течение 15 минут, используя предварительно подогретую 50% гибридизационную смесь в TBST. Затем дважды промойте образцы раствором TBST, после чего инкубируйте ткань в TBST при комнатной температуре на качалке в течение 30 минут. Далее проведите предварительную инкубацию эксплантов в блокирующем растворе минимум два часа.

Затем замените раствор свежим блокирующим раствором, содержащим антитела к дигоксигенину, конъюгированные с HRB, в разведении 1:200. Инкубируйте образцы при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день трижды промойте образцы раствором TBST при комнатной температуре и перенесите их в отдельные лунки новой 24-луночной культуральной пластины.

Затем трижды промойте экспланты в TBST, выдерживая по одному часу для каждой промывки. Перед подготовкой образцов к визуализации используйте набор для усиления сигнала тирамидом для визуализации детектированной мРНК. Подготовьте по одному заряженному адгезивному предметному стеклу для каждой пары эксплантов, сняв защитную клейкую пленку с имиджингового спейсера толщиной 0.12 mm и прикрепив его к предметному стеклу.

После размещения пары эксплантатов на предметном стекле согласно текстовому протоколу, дайте образцам прикрепиться к стеклу в течение 45-60 секунд, пока ткань не станет липкой и полупрозрачной, не допуская ее полного высыхания. В это время с помощью пинцета удалите оставшуюся клейкую подложку с ограничителя и добавьте большую каплю комбинированного закрепляющего средства и просветляющего раствора на образцы в центре ограничителя. Накройте образцы кругным покровным стеклом, убедившись, что закрепляющее средство распределено равномерно и все края стекла соприкасаются с ограничителем.

Затем положите предметное стекло с покровным стеклом лицевой стороной вниз на безворсовую бумагу. Плотно прижмите, чтобы покровное стекло полностью прилегло к прокладке, а излишки заключающей среды были удалены. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока заключающая среда не перестанет проступать на бумаге.

Очистите и промаркируйте предметное стекло, затем храните его в темном месте до проведения визуализации. После этого выполните визуализацию и анализ согласно текстовому протоколу. В данном эксперименте показано, что экспрессия белков Delta-Like 1 и Notch1 осциллирует несинхронно путем временного распределения эмбрионов в зависимости от начинающейся транскрипции интронного гена lunatic fringe сегментационного часового механизма, регулируемого Notch, который детектируется в одной половине каждой пары эксплантов.

Панели расположены в соответствии с первой, второй и третьей фазами цикла сегментационных часов. Области экспрессии Delta-Like 1, Notch1 и интронного lunatic fringe вдоль передне-задней оси ПСМ обозначены цветовыми полосами. Как показано здесь, построен график для количественной оценки интенсивности сигналов Delta-Like 1, Notch1 и интронного lunatic fringe относительно передне-задней оси ПСМ, который иллюстрирует осевую вариативность и интенсивность сигнала в ПСМ на протяжении всего цикла часов.

Кимографы визуализируют пространственное распределение Delta-Like 1, Notch1 и интронного lunatic fringe в многочисленных PSM. Каждая строка кимографа представляет интенсивность сигнала отдельного экспланта PSM. Количественный анализ интенсивности сигнала Delta-Like 1, Notch1 и интронного lunatic fringe относительно передне-задней оси PSM выявляет четкую осцилляторную динамику экспрессии этих мишеней.

Наконец, на этих кимографах показано пространственное распределение расщепленной и активированной формы рецептора Notch (NICD), Delta-Like 1, интронного lunatic fringe и Notch1 в многочисленных PSM. Данный метод помог исследователям в области митогенеза позвоночных лучше понять динамику осцилляции генов сегментации в пресомитной мезодерме цыпленка и мыши. После освоения этот метод может быть применен к большому количеству образцов, что позволяет одновременно анализировать профили экспрессии нескольких интересующих мРНК и белков.

После выполнения данной процедуры дополнительный количественный анализ данных изображений позволит понять временные задержки в экспрессии генов, а также определить субклеточную локализацию интересующих исследователя сигналов РНК и белков. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как картировать пространственно-временную динамику экспрессии генов сегментационного clock позвоночных, используя забор проб из толстых срезов тканей. Затем может последовать автоматизированный анализ изображений, подробно описанный в текстовом протоколе.

При выполнении данной процедуры важно обеспечить равное распределение PSM, нехорды и нервной трубки между эксплантатами PSM, а также тщательно оптимизировать разведения антител перед началом работы. Помните, что работа с формамидом, параформальдегидом и глутаральдегидом может быть крайне опасной. Обязательно используйте средства индивидуальной защиты и работайте в вытяжном шкафу, где это применимо.