Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии
9 декабря 2011 г.
Полный процесс от мозга подготовки образца до серийного секционирования визуализации с использованием ножа сканирующий микроскоп, для визуализации и анализа данных описывается. Эта техника в настоящее время используется для получения данных мозга мыши, но она применима и к другим органам, другим видам.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать процесс подготовки биологических образцов для секционирования и визуализации с помощью сканирующего микроскопа с лезвием (KESM), а также визуализацию полученного стека изображений. Это достигается путем предварительной фиксации, окрашивания и заливки ткани для подготовки к исследованию на KESM. Вторым этапом процедуры является настройка KESM, проведение секционирования и получение изображений с использованием программного обеспечения для автоматического управления.
Затем полученные изображения подвергают шумоподавлению, совмещению и обрезке. Заключительный этап заключается в загрузке и изучении наборов данных в веб-атласе и программном обеспечении для 3D-визуализации. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие организацию нейронов и сосудов на уровне всего мозга с субмикронным разрешением.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами мезоскопии, такими как серийное сканирующее электронное микроскопирование блоков, является возможность визуализации гораздо больших объемов, хотя и при более низком разрешении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области коннектомики и нейронауки в целом. Данный подход позволяет получить представление о структурной организации мозга, а также может быть применен к другим системам органов, таким как легкие и почки.
Для начала данной процедуры вскрытый мозг мыши помещают в стеклянную банку с раствором Гольджи-Кокса. Стеклянную банку помещают в светонепроницаемый контейнер при комнатной температуре на срок от 10 до 16 недель. Отдельный этап фиксации не требуется, так как раствор Гольджи-Кокса одновременно служит фиксатором.
Через 10–16 недель промойте мозг в деионизированной воде в течение ночи в темноте, на следующий день погрузите промытый мозг в 5% раствор гидроксида аммония в деионизированной воде на семь–десять дней в темноте при комнатной температуре. Через семь–десять дней снова промойте мозг в деионизированной воде при комнатной температуре в течение четырех часов. Затем проведите дегидратацию мозга с использованием серии растворов этилового спирта возрастающей концентрации, выдерживая образец в каждом растворе по 24 часа: 50% ethanol и 70% ethanol при температуре четырех градусов Цельсия, а затем 85% ethanol.
Трижды замените 95% ethanol и четыре-пять раз замените 100% ethanol при комнатной температуре. Затем поместите обезвоженный мозг в acetone и проведите три-четыре замены, по одному дню на каждую. После этого выдержите мозг в холодильнике в течение ночи в каждой из следующих смесей aite и acetone с соотношением aite к acetone 1:2, 1:1 и 2:1.
В завершение поместите мозг в 100% aite в холодильник, выполнив три смены раствора с интервалом в одни сутки для каждой. Затем обработанный мозг заливают 100% aite и выдерживают при температуре 60 °C в течение трех дней. Наконец, подготовленный блок образца фиксируют на металлическом кольце для образцов с помощью эпоксидного клея, при необходимости подрезая края блока для начала данной процедуры.
Убедитесь, что мышь находится в состоянии глубокого наркоза и не реагирует на щипковый раздражитель пальца лапы. Затем проведите транскардиальную перфузию мыши фосфатсолевым буфером комнатной температуры, после чего используйте холодный 4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере. Далее проведите перфузию мыши раствором 0.1% тионина в деионизированной воде.
После этого поместите тело в холодильник при температуре 4 °C на 24 часа. По истечении 24 часов извлеките мозг из калвера и поместите его в свежий раствор 0,1% тионина. Оставьте мозг при температуре 4 °C на семь дней.
Через семь дней зафиксируйте и дегидратируйте мозг, используя серию растворов этилового спирта возрастающей концентрации. В течение шести недель выдерживайте образец: от трех до пяти дней в 50% ethanol, от семи до 10 дней в 70% ethanol, примерно по две недели в 85% и 95% ethanol, а оставшееся время — в 100% ethanol. После трехкратной смены ацетона при комнатной температуре мозг заливают в эрудированную пластику в печи при 60 °C.
Для начала процедуры окрашивания сосудистой сети тушью «Индия» убедитесь в глубоком наркозе мыши по отсутствию рефлекса отдергивания лапы. Затем проведите транскордиальную перфузию мыши фосфатно-солевым буферным раствором комнатной температуры, после чего используйте 10%-ный нейтральный буферизированный формалин комнатной температуры. Перфузия всего тела физраствором и фиксатором необходима для удаления крови из сердечно-сосудистой системы и фиксации тканей.
Затем проведите перфузию мыши 3,0 ccs неразбавленной перфузионной индийской тушью. Использование индийской туши необходимо для полного заполнения сосудов сердечно-сосудистой системы. После извлечения мозга из организма мыши полученный образец подвергают дегидратации в серии растворов этилового спирта возрастающей концентрации, после чего заливают в специальный пластик.
Следуя описанному ранее протоколу по подготовке KESM для визуализации, включите камеру, осветитель и предметный столик, поднимите нож и объектив. Затем установите кольцо для образца. После этого опустите объектив и нож.
Измерьте размеры образца. Затем создайте файл конфигурации для контроллера столика KESM. Перед инициализацией столика поднимите нож и объектив KESM.
Запустите контроллер столика KESM stage controller two и инициализируйте столик. Затем опустите нож и объектив, и включите насос. Сфокусируйте объектив и камеру, поворачивая ручку фокусировки на оптическом тракте и настраивая поле зрения камеры относительно кромки ножа.
Нажимайте пошагово, чтобы проверить первые несколько этапов визуализации и секционирования. Затем нажмите «go» (пуск), чтобы начать процесс визуализации и секционирования для последующей обработки изображений.
Запустите процессор стека KESM для удаления артефактов освещения и нормализации интенсивности фона на всех изображениях. Повторите процедуру для всех подпапок с данными. Чтобы визуализировать данные с помощью атласа мозга KESM, перейдите на этот веб-сайт и выберите соответствующий атлас для перехода на другую глубину.
Выберите в выпадающем меню необходимую глубину для каждого шага, затем нажмите «плюс», чтобы увеличить, или «минус», чтобы уменьшить глубину по оси Z. Другие доступные опции включают масштабирование или навигацию по атласу мозга KESM. Используйте выпадающее меню для настройки номера и интервала наложения слоев, чтобы визуализировать данные с помощью VIS lab.
Запустите приложение и создайте новый проект. Проект должен включать в себя следующие узлы: «compose 3D from 2D files», «set world matrix arithmetic one» и «view 3D connected». В указанном порядке установите соответствующие параметры в узле «view 3D», удерживая правую кнопку мыши.
Перемещайте мышь, чтобы настроить области порога, которые можно обрезать. Изменялась ориентация, менялось освещение или включался/выключался фон. Репрезентативные результаты KESM проиллюстрированы следующими видеоклипами; в начале представлены объемные визуализации KESM, стеки данных всего мозга, окрашенных тушью, для набора сосудистых данных, начиная с крупного плана сосудов шириной около 100 microns.
Этот второй клип KESM с данными инъекции индийских чернил во весь мозг демонстрирует три стандартные проекции сосудов всего мозга мыши, полученные путем субдискретизации данных высокого разрешения с шириной около 10 миллиметров. Представлены сагиттальная, корональная и горизонтальная проекции, а также пролет сквозь корональный срез. В данном видеоклипе проиллюстрированы данные метода Гольджи для всего мозга мыши, который демонстрирует пролет вдоль трех различных плоскостей сечения, начиная с общего вида блока, за которым следуют сагиттальная, корональная и горизонтальная проекции.
Далее представлены подробности данных GoGy всего мозга мыши, полученных методом KESM. Первый видеоклип демонстрирует мозжечок и клетки Пуркинье. Второй клип показывает кору головного мозга и париетальные клетки.
Наконец, KESM. Данные NLE всего мозга представлены в этих двух видеоклипах. Сначала показан крупный план данных NLE.
На этом втором видеоролике представлены три стандартные проекции данных Nle всего мозга мыши, полученных путем субдискретизации данных высокого разрешения. Также показан поперечный срез для четкого отображения внутренних структур. После этой разработки данный метод открыл исследователям в области нейробиологии возможность изучать нейронные и сосудистые сети мозга мыши.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о подготовке образцов, получении изображений и анализе данных для сканирующего микроскопа с лезвием (knife edge scanning microscope).
Обзор
В данной статье подробно описывается процесс подготовки образцов мозга для визуализации с помощью сканирующего микроскопа с ножевым лезвием (Knife-Edge Scanning Microscope, KESM). Этот метод в первую очередь применяется к мозгу мышей, однако он также актуален для других органов и видов животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Коннектомика
- Методы визуализации
Теоретическая часть
- Метод KESM позволяет визуализировать большие объемы биологических образцов.
- Данный метод дает представление об организации нейронов и сосудов.
- Он имеет преимущества перед традиционными методами, такими как серийная сканирующая электронная микроскопия блоков (SBF-SEM).
- Применим к различным системам органов, помимо головного мозга.
Цель исследования
- Продемонстрировать подготовку и визуализацию биологических образцов.
- Визуализировать и проанализировать данные, полученные с помощью KESM.
- Изучить структурную организацию с субмикронным разрешением.
Используемые методы
- Фиксация, окрашивание и заливка тканей мозга.
- Настройка и работа KESM для получения изображений.
- Обработка данных, включая шумоподавление и регистрацию.
- Визуализация данных с помощью веб-атласа и программного обеспечения для 3D-моделирования.
Основные результаты
- Успешная визуализация структур всего мозга с высоким разрешением.
- Визуализация нейронных и сосудистых сетей.
- Демонстрация способности KESM обрабатывать большие объемы.
- Понимание структурной организации мозга и других органов.
Выводы
- KESM является мощным инструментом для исследований в области коннектомики.
- Этот метод расширяет наше понимание структуры мозга.
- Он может быть адаптирован для использования с различными биологическими образцами.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод сканирующей микроскопии с использованием ножевидного лезвия (KESM) позволяет получать высокопроизводительные 3D-изображения целых органов с субмикронным разрешением, предоставляя критически важные эталонные данные для коннектомики и нейрососудистых исследований. Данная возможность поддерживает валидацию мишеней на ранних этапах, раскрывая структурную организацию нейронных и сосудистых сетей в системах, имеющих значение для изучения заболеваний. Метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, предоставляя количественные и воспроизводимые анатомические наборы данных для снижения механистических рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью картирования архитектуры нейронов и сосудов всего мозга с субмикронным разрешением.
- Практическая ценность: Предоставляет точные эталонные данные для стереологии и коннектомики, снижая механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: Облегчает сортировку портфеля разработок, предоставляя количественные структурные показатели, которые коррелируют с функциональными результатами в моделях заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые стеки 3D-изображений, подходящие для последующего анализа структурных изменений, вызванных воздействием соединений.
- Практическая ценность: Обеспечивает автоматизированные рабочие процессы секционирования и визуализации с постоянным разрешением по оси Z, что повышает воспроизводимость анализа в различных исследованиях.
- Масштабируемость: Облегчает подготовку валидированных биологических систем (например, мозга, легких, почек мыши) для применения в высокопроизводительном скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает визуализацию систем, имеющих значение для изучения заболеваний (например, мозга грызунов, мозга осьминога, эмбрионов данио-рерио), что соответствует задачам поиска трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет предоставления лонгитюдных многомасштабных анатомических данных.
- Снижение рисков: способствует принятию обоснованных решений о дальнейшем продвижении исследований, позволяя точно количественно оценивать нейроваскулярные изменения в доклинических моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
KESM вписывается в континуум разработки лекарственных средств, начиная с раннего тестирования гипотез о мишенях, через идентификацию соединений-лидеров и заканчивая доклинической валидацией, особенно для мишеней в области нейронаук и сосудистой системы.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей посредством визуализации нейронных и сосудистых сетей всего органа.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные 3D-наборы данных, готовые к анализу, с количественными показателями для оценки структурных фенотипов.
- Аналитика: обеспечивает обработку данных (шумоподавление, регистрацию, обрезку) и визуализацию с помощью веб-атласов и программного обеспечения для 3D-анализа для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность благодаря применимости к различным видам (мышь, крыса, данио-рерио, осьминог) и визуализации всего органа.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая платформа визуализации для проведения межпроектных кампаний по картированию нейроанатомии и сосудистой системы.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней посредством структурного фенотипирования всего органа с высоким разрешением.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость сбора 3D-данных в различных лабораториях и модельных системах.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних этапах путем раннего структурного анализа рисков.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков на основе количественных анатомических конечных точек, которые определяют критерии продвижения.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области гистологии, обработки тканей и использования микроскопического оборудования.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая микротом, оптический стол и программное обеспечение для автоматического управления работой KESM.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов окрашивания (например, методы Гольджи, тушью, по Нисслю) и процедур заливки.
- Требуется адаптация методов для различных модельных систем (например, мозг мыши в сравнении с эмбрионом данио-рерио) в связи с различиями в размере и плотности тканей.
- Ограничение по длительным срокам подготовки образцов (от нескольких недель до месяцев) на этапах фиксации и дегидратации.
