Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в демонстрации подготовки биологических образцов к срезу и визуализации под сканирующим микроскопом с режущей кромкой ножа (КЕСМ) и визуализации полученных данных стека изображений. Это достигается путем предварительной фиксации, окрашивания и встраивания ткани для подготовки ее к визуализации под КЭСМ. Вторым этапом процедуры является настройка КЭСМ и проведение секционирования и визуализации с помощью автоматизированного программного обеспечения.

Полученные изображения затем регистрируются и обрезаются без шума. Последним шагом является загрузка и изучение наборов данных в веб-атласе и программном обеспечении для 3D-визуализации. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают весь уровень мозга, нейронную и сосудистую организацию с субмикрометровым разрешением.

Основное преимущество этой методики перед существующими Mesos, такими как сканирующая электромикроскопия с последовательным блоком, заключается в том, что она позволяет визуализировать гораздо большие объемы, хотя и с более низким разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области коннектомики и нейронауки в целом. Этот метод может дать представление о структурной организации мозга, а также может быть применен к другим системам органов, таким как легкие и почки.

Чтобы начать эту процедуру, расчлененный мозг мыши помещают в стеклянную банку, содержащую раствор Гольджи Кокса. Поместите стеклянную банку в светоплотный ящик при комнатной температуре на 10-16 недель. Отдельный этап фиксации не требуется, так как раствор Гольджи Кокса работает как фиксатор.

Через 10-16 недель промойте мозг в деионизированной воде на ночь в темноте на следующий день, погрузите промытый мозг в 5% раствор гидроксида аммония в деионизированную воду на 7-10 дней в темноте при комнатной температуре. Через семь-десять дней снова промойте мозг в деионизированной воде комнатной температуры в течение четырех часов. Затем обезвоживайте мозг с помощью градуированного ряда этиловых спиртов, оставляя его в каждом растворе на 24 часа, 50% этанола и 70% этанола при четырех градусах Цельсия и 85% этанола.

Три замены 95% этанола и четыре-пять смен 100% этанола при комнатной температуре. Затем поместите обезвоженный мозг в ацетон и выполните три-четыре изменения в течение одного дня. После этого поместите мозг на ночь в холодильник в каждую из этих ацетоновых смесей с соотношением аит к ацетону один к двум, один к одному и два к одному.

Наконец, поместите мозг в 100%aite в холодильник, выполняйте три смены каждый раз на ночь. Затем обработанный мозг помещают в 100% аит и нагревают до 60 градусов Цельсия в течение трех дней. Наконец, отвержденный блок образца устанавливается на металлическое кольцо образца, используя эпоксидную смолу, и боковые стороны блока обрезаются по мере необходимости для начала этой процедуры.

Убедитесь, что мышь глубоко обезболечена и не реагирует на щипывание пальца ноги. Затем мышь перфузировали сердечно с использованием фосфатно-солевого буфера комнатной температуры, а затем холодного 4%-ного фосфатного буферного параформальдегида. Далее перфузируйте мышь раствором 0,1%thi и окрасьте в деионизированной воде.

После этого поместите тело в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 24 часа. Через 24 часа извлеките мозг из тельца и поместите в свежий раствор 0,1%-ный тионин. Оставьте мозг при температуре четыре градуса Цельсия на семь дней.

Через семь дней задержите и обезвожьте мозг с помощью градуированного ряда этиловых спиртов. В течение шести недель, от трех до пяти дней в 50% этаноле, от семи до 10 дней в 70% этаноле, около двух недель в 85% и 95% этаноле, а остальное время в 100% этаноле. После трех смен ацетона при комнатной температуре мозг встраивается в эрудированный пластик в духовке при температуре 60 градусов Цельсия.

Чтобы начать процедуру окрашивания сосудистой сетки индийскими чернилами, подтвердите по отсутствию рефлекса отвода пальцев ноги, что мышь глубоко обезболивается. Затем сердечно перфузируйте мышь, используя фосфатный буферный раствор комнатной температуры, а затем 10% нейтральный буферизованный формин комнатной температуры. Перфузия всего тела с солевым и фиксирующим растворами необходима для выведения крови из сердечно-сосудистой системы и фиксации тканей.

Затем нанесите на мышь 3,0 куб. см перфузии неразбавленных индийских чернил. С помощью индийских чернил необходимо полностью заполнить сосудистую сеть сердечно-сосудистой системы. После извлечения из мыши, полученный мозг обезвоживается с помощью ряда градуированных этиловых спиртов, а затем помещается в эрудированный пластик.

Следуя показанному ранее протоколу для настройки КЭСМ для визуализации, включите камеру, осветитель и сцену, поднимите нож и объектив. Далее устанавливаем кольцо для образца. Затем опустите объектив и нож.

Измерьте размеры образца. Затем создайте файл конфигурации для контроллера сцены КЕСМ. Два применения, поднятие ножа и объектив КЭСМ перед инициализацией этапа.

Запустите второй контроллер сцены KESM и инициализируйте сцену. Затем опустите нож и мишень и включите насос. Сфокусируйте объектив и камеру, повернув ручку фокусировки на оптическом механизме и отрегулировав поле зрения камеры относительно лезвия ножа.

Нажмите шаг за шагом, чтобы проверить первые несколько шагов визуализации и раздела. Затем нажмите «Перейти». Для запуска визуализации и секционирования для обработки изображений.

Запустите стековый процессор KESM для удаления артефактов освещения и нормализации интенсивности фона на всех изображениях. Повторите эти действия для всех вложенных папок данных. Чтобы визуализировать данные с помощью атласа мозга КЕСМ, перейдите на этот сайт и выберите подходящий атлас для перехода на другую глубину.

Выберите в раскрывающемся меню, насколько глубоко нужно углубиться на каждом шаге, а затем нажмите на плюс, чтобы увеличить, или на минус, чтобы уменьшить глубину Z. Другие варианты включают увеличение масштаба или навигацию с помощью атласа мозга KESM. Используйте раскрывающееся меню, чтобы настроить количество наложения и интервал наложения для визуализации данных с помощью VIS lab.

Запустите приложение, создайте новый проект. Проект должен включать в себя составление 3D из 2D файлов, набор мировой матрицы, арифметику и вид 3D подключенных. В таком порядке должны быть установлены соответствующие параметры, как показано в окне 3D при нажатии правой кнопки мыши.

Перемещайте мышь, чтобы настроить пороговые области, которые можно обрезать. Изменилась ориентация, изменилось освещение, а также включился или выключился фон. Репрезентативные результаты KESM проиллюстрированы следующими видеоклипами, показанными первыми, представляют собой объемную визуализацию KESM, целых стеков данных чернил Brain India для набора сосудистых данных, начиная с крупного плана сосудистых данных шириной около 100 микрон.

Этот второй клип KESM, данные Brain India Ink показывают три стандартных вида сосудистой сети всего мозга мыши, субботники, отобранные из данных с высоким разрешением шириной около 10 миллиметров. Сагиттальный вид, корональный вид и горизонтальный вид, а также пролет коронального разреза. КЭСМ. Данные Гольджи всего мозга мыши проиллюстрированы в этом видеоклипе, который показывает пролет вдоль трех различных плоскостей разрезания, начиная с блочного вида, за которым следуют сагиттальный вид, корональный вид и горизонтальный вид.

Далее приведены подробные данные GoGy всей головной мыши КЕСМ. Этот первый видеоклип посвящен клеткам мозжечка и Пуркинье. Во втором клипе показаны клетки коры и параметалла.

Наконец, KESM. Данные всего мозга nle проиллюстрированы в этих двух видеоклипах. На первом снимке показаны данные системы нелинейного монтажа крупным планом.

Во втором клипе показаны три стандартных вида всего мозга мыши: субтитры данных Nle, отобранные из данных с высоким разрешением. Также показан поперечный разрез для четкого представления внутренних конструкций После этой разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению нейронных и сосудистых сетей в мозге мыши.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о подготовке образцов, визуализации и анализе данных для сканирующего микроскопа с лезвием ножа.