Использование иммуногистохимического метода цельного монтирования для изучения иннервации билиарного тракта в Солнце

Общая цель этой процедуры заключается в использовании иммуногистохимического окрашивания для визуализации распределения нервов в желчных путях Suncus murinus. Этот метод может быть использован для анализа нервного распределения висцеральных органов многих видов, особенно неправильных или мелких органов, которые трудно оценить стандартными методами. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что операция проста.

Он не требует сложных процедур и имеет высокий процент успеха. Вместе со мной эту процедуру будут демонстрировать аспирант Йидань Дай и научный сотрудник Шуан-Цинь И, оба из моей лаборатории. Начните с промывания животного индивидуальными PBS и 4% параформальдегидными перфузиями в вытяжном шкафу.

Затем введите два-три миллилитра белого неопренового латекса через перфузионный катетер в брюшную аорту, чтобы пометить кровеносные сосуды. И когда все интересующие ткани будут помечены, извлеките органы брюшной полости и связанные с ними нервы и сосуды. Затем введите примерно 0,1 миллилитра синего неопренового латекса в желчный пузырь, чтобы пометить желчевыводящую систему, и закрепите ткани в 4% параформальдегиде на ночь при температуре четыре градуса Цельсия для полного иммуноокрашивания.

На следующее утро переложите образец в стеклянный флакон на четыре часовые промывки при комнатной температуре в дистиллированной воде на нутаторе. После последней промывки инкубируйте ткани в свежеприготовленной 1%-ной ортопериодической кислоте в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы предотвратить любые собственные пероксидазные реакции. Далее образец промыть в дистиллированной воде в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего провести инкубацию в свежеприготовленном 0,004%-ном папильоне в течение двух часов на водяной бане постоянной температуры при температуре 37 градусов Цельсия с легким покачиванием.

В конце инкубации промойте экземпляр дистиллированной водой в течение 50-60 минут. Затем храните ткани в 4% параформальдегиде при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующее утро промойте образец в дистиллированной воде, как только что было показано, а затем еще раз проведите двухчасовую инкубацию в свежеприготовленном папильоне.

Промойте образец еще от 50 до 60 минут в дистиллированной воде с последующей фиксацией на ночь в 4% параформальдегиде. На третье утро промойте ткани четыре раза в дистиллированной воде с последующим погружением в три последовательных восходящих 30-минутных инкубации сахарозы. Затем заморозьте образец при температуре минус 20 градусов Цельсия на 30-60 минут с последующим полным размораживанием при комнатной температуре.

После третьего цикла замораживания-размораживания перенесите образец в 2%-ный Triton X-100 для ночной инкубации при температуре четыре градуса Цельсия. На следующее утро перенесите образец в контейнер с первичным антителом, представляющим интерес, для осторожного покачивания на нататоре при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-шести дней в зависимости от размера образца. По истечении соответствующего периода мечения удалите несвязанное первичное антитело четырьмя одночасовыми промывками в PBS при комнатной температуре и пометьте образец соответствующим вторичным антителом на три дня с легким покачиванием при четырех градусах Цельсия.

По окончании периода вторичного мечения антителами промыть образец четыре раза в PBS. Затем инкубируйте ткани в 10 микролитрах 30% перекиси водорода в 100 мл свежеприготовленного 0,002% раствора красителя DAB при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16-72 часов с легким покачиванием. Когда будет достигнута оптимальная интенсивность окрашивания, переведите образец в 0,04%-ный азид натрия в PBS, чтобы остановить реакцию окрашивания.

Затем осторожно погрузите образец в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую свежий PBS, и сделайте целые снимки тканей с помощью камеры, установленной на стереомикроскопе. В дополнение к визуализации иннервации внепеченочных желчевыводящих путей, мечение антителами против положительных нервных волокон нейрофиламентов также позволяет однозначно идентифицировать плотность хода и распределения блуждающего нерва вдоль пищевода и в желудок. Маркировка кровеносных сосудов желчного пузыря белым неопреновым латексом выявляет тонкий нервный фиброз в высоком контрасте с окружающими тканями с более высокой плотностью иннервации, наблюдаемой в шейке желчного пузыря, чем на глазном дне.

В верхних желчных протоках мечаются два типа нервных пучков: тонкие нервные пучки, которые образуют неправильную и плотную сеть нервов и проходят по кровеносным путям, находящимся на желчевыводящих путях и в них, и более толстые нервные пучки, которые распределены параллельно поверхности желчевыводящих путей. Маркировка общего желчного протока синим неопреновым латексом и сосудов белым неопреновым латексом позволяет визуализировать тонкие нервные волокна в конце общего желчного протока и в области дуоденального сосочка. Прежде чем приступать к этой процедуре, позаботьтесь о том, чтобы воспроизвести график для каждого из экспериментов, так как весь процесс требует от двух до трех недель для завершения.

Чтобы не повредить образец при смене растворов, всегда выливайте растворы, а не удаляйте образец щипцами. После просмотра этого видео вы сможете применять эту технику для обозначения ряда нервов в различных висцеральных органах.