Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки

Общая цель данной процедуры — визуализация стероидогенных органов и взаимодействующих с ними органов у личинок или взрослых самок плодовой мушки Drosophila melanogaster. Этот метод может помочь в понимании биосинтеза стероидных гормонов у насекомых, а также нейрональных регуляторных механизмов, лежащих в основе спаривания и метаморфоза. Основным преимуществом данной методики является сохранение иннервации стероидогенных органов и относительной целостности взаимодействующих с ними органов.

Как правило, специалистам, впервые применяющим этот метод, бывает трудно, поскольку стероидогенные органы личинок мухи очень малы и прозрачны. Мы с коллегами по лаборатории рады поделиться нашими протоколами диссекции. Итак, приступим.

После подготовки личинок приступите к препарированию в чашке диаметром три сантиметра, наполненной PBS, под стереомикроскопом. Сначала захватите ротовой крючок пинцетом. Затем с помощью микроножниц отсеките тело примерно на одной трети длины от переднего конца.

Затем зажмите передний конец одной парой пинцетов и с помощью второй пары осторожно протолкните кончик головы внутрь тела, чтобы в итоге вывернуть тело личинки наизнанку. Таким образом подготовьте до 20 личинок в течение 10 минут, после чего перенесите их в фиксирующий раствор. Через 30 минут промойте препараты и приступайте к иммуноокрашиванию.

Для начала оставьте личинок в воде примерно на один час, чтобы вызвать асфиксию и тем самым иммобилизовать их. Затем поместите личинку спинной стороной вверх в каплю PBS на блюдо с силиконовым покрытием. На спинной стороне расположены две трахейные трубки.

Под диссекционным микроскопом с помощью пинцета вставьте энтомологическую булавку в передний конец. Затем растяните тело в сторону задней части и вставьте вторую булавку в задний конец. После этого с помощью микрохирургических ножниц сделайте небольшой разрез рядом с хвостом.

От места надреза осторожно разрежьте дорсальную кутикулу продольно вдоль дорсальной срединной линии в направлении головы, стараясь не повредить ткани под кутикулой. После выполнения разреза раздвиньте стенки тела и закрепите их энтомологическими булавками по углам. Затем с помощью пинцета удалите переднее жировое тело и слюнные железы, чтобы обнажить на поверхности комплекс мозгового кольца и желез.

Теперь аспирируйте PBS и погрузите препарат в фиксирующий раствор. Через 30 минут с помощью пинцета извлеките энтомологические булавки и перенесите препарат в микроцентрифужную пробирку, заполненную 0,3% PBT. Затем приступайте к иммуноокрашиванию.

После иммуноокрашивания личинок с помощью одноразовой пипетки перенесите образцы в чашку с 0,3% PBT. Под dissecting microscope захватите кутикулу или ротовой крючок одним пинцетом. Затем, используя иглу 27G, закрепленную на шприце объемом 1 мл, в качестве скальпеля, отделите комплекс «мозг — кольцевидная железа — глазной диск» от кутикулы тела, отрезав передний конец пищевода и глазные диски.

Затем с помощью пинцета осторожно отделите пищевод и кишечник от комплекса «мозг-кольцевидная железа-глазной диск». Вытяните кишечник на заднюю сторону, поскольку пищевод проходит через мозг над брюшным нервным стволом. Наконец, чтобы изолировать комплекс «мозг-кольцевидная железа», осторожно перережьте с помощью игольчатого ножа связи между диском мозга, глазными дисками и дисками конечностей.

При проведении диссекции крайне важно использовать тонкий пинцет с острыми краями. Я настоятельно рекомендую заточить пинцет с помощью точильного камня так, чтобы его кончики плотно смыкались без зазоров. Для переноса образцов используйте микропипетку с наконечником с широким отверстием.

Поместите образцы в центр предметного стекла. Затем с помощью пинцета переверните образцы на брюшную сторону, чтобы можно было визуализировать кольцевидную железу, расположенную на дорсальной стороне мозга. Далее наклоните стекло и удалите максимально возможный избыток PBT.

Затем поместите каплю фиксирующего реагента рядом с образцами и с помощью пинцета медленно опустите покровное стекло сначала на реагент, а затем на образцы. Для препарирования яичника взрослой самки анестезируйте мух углекислым газом. Затем отсеките им головы и перенесите тела в чашку диаметром три сантиметра, наполненную PBS.

Затем под диссекционным микроскопом захватите пинцетом дорсальную сторону груди, а второй парой пинцетов удержите абдоминальный сегмент A-5 или A-6. После этого отделите кутикулу брюшка, потянув её в сторону заднего конца тела. Перед тем как продолжить, очистите пинцеты от прилипшей кутикулы.

Затем пережмите яйцевод и изолируйте яичник. После этого с помощью пинцета расправьте и раздвиньте кончики яичника. После расправления погрузите яичник в фиксирующий раствор на 30 минут для подготовки к окрашиванию.

Для получения препарата с сохраненной иннервацией яичника перенесите обезболивших самок мух в чашку с силиконовым покрытием, заполненную PBS. Под диссекционным микроскопом зафиксируйте хоботок и удалите кутикулу головы, чтобы обнажить мозг. Отделите от мозга прикрепленную трахею, оставив мозг соединенным с брюшным нервным стволом.

Затем зажмите грудной отдел со стороны спины и удалите ноги и крылья. Далее отделите вентральную кутикулу грудного отдела, начиная от основания каждой ноги. После обнажения VNC очень осторожно удалите с помощью пинцета остатки дорсальной кутикулы и прикрепленные к VNC мышцы.

Не повредите соединения между мозгом и VNC. Затем с помощью пинцета снимите кутикулу брюшка, чтобы обнажить яичники и связанные с ними органы, включая опору, кишечник, яйцевод, матку и вспомогательную железу. В завершение удалите все остаточные ткани, включая трахеи и жировое тело.

Затем погрузите образцы в фиксирующий раствор на 30 минут для подготовки к иммуноокрашиванию. После иммуноокрашивания перенесите образцы на предметное стекло с 0,1% PBT с помощью микропипетки. Затем изучите препарат под микроскопом и разделите цепочки овариол друг от друга с помощью пинцета.

Следите за тем, чтобы не повредить концы овариол в процессе выполнения данной процедуры, так как в них расположены гермарии. При подготовке комплекса «головной мозг — репродуктивные органы» удалите остатки кутикулы и аккуратно разложите структуры на предметном стекле.

Затем удалите большую часть излишков PBT и нанесите одну каплю закрепляющего реагента на образец. После этого с помощью пинцета медленно поместите покровное стекло на предметное стекло и храните препарат при температуре four degrees celsius в темноте. Позже исследуйте образцы под микроскопом, переместив стероидогенные органы в поле зрения.

После фиксации обзора переключите систему визуализации в режим захвата изображения. На личиночных стадиях проторакальная железа была помечена антителами к экдистероидным ферментам, включая антитела к белку shroud. Для визуализации нейронной связи между проторакальной железой и мозгом был произведен диссекционный разрез комплекса «мозг — кольцевидная железа».

Метод препарирования филе позволяет визуализировать стоматогастрическую нервную систему, в которой группа серотонинергических нейронов проецируется на проторакальную железу, провентрикулюс и мышцы глотки. У взрослых самок яичниковый экдистероид влияет на многие аспекты овогенеза, такие как пролиферация GSC. GSC расположены в гермарии на кончике каждой овариолы в яичнике.

В гермарии GSC были специфически помечены с помощью двух антител, 1B1 и DE-cadherin. Для визуализации иннервации яичника была проведена диссекция яичника вместе с мозгом, брюшной нервной цепочкой (VNC), кишечником, пробосцисом, маткой и сперматекой. Нейроны были визуализированы с помощью mCD8:GFP под контролем драйвера n-Synaptobrevin GAL4.

Кроме того, структура мышц была окрашена с использованием конъюгированного фаллоидина. Хотя диссекция стероидогенных органов поначалу может показаться сложной, используйте это видео, чтобы определить точки разреза тканей для более легкой изоляции органа без повреждений. Мы надеемся, что наш протокол будет информативным не только для начинающих, но и для опытных исследователей.

После освоения данной методики вы сможете применять ее в своих исследованиях, адаптируя под конкретные задачи. Мы надеемся, что данный протокол будет способствовать всестороннему пониманию биосинтеза стероидных гормонов. Более подробные пошаговые инструкции представлены в рукописи.

Пожалуйста, ознакомьтесь.