Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки Дрозофилы

Общей целью этой процедуры является визуализация стероидогенных органов и их интерактивных органов у личинок или взрослых самок плодовой мушки Drosophila melanogaster. Этот метод может помочь понять биосинтез стероидного гормона насекомых и механизм нейронной регуляции, лежащий в основе спаривания и метаморфоза. Основное преимущество этой методики заключается в том, что иннервация стероидогенных органов и относительная часть их интерактивных органов остается нетронутой.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что стероидогенные органы у личинок мух довольно крошечные и прозрачные. Моя лаборатория и я с удовольствием делимся нашими протоколами вскрытия. Итак, приступим.

После подготовки личинок приступайте к курсовой вскрытию в трехсантиметровой посуде, наполненной PBS, под препарирующим микроскопом. Сначала захватите крючок для рта щипцами. Затем с помощью микроножниц разрежьте тело примерно на треть длины от переднего кончика.

Затем удерживайте переднюю длину одной парой щипцов и используйте вторую пару, чтобы аккуратно вдавить кончик головы в тело, чтобы в конечном итоге вывернуть тело личинки наизнанку. Подготовьте таким образом до 20 личинок в течение 10 минут, а затем перенесите их в фиксирующий раствор. Через 30 минут промойте препараты, и приступайте к иммуноокрашиванию.

Для начала оставьте личинок погруженными в воду примерно на один час, чтобы они задохнулись и таким образом обездвижили личинок. Затем поместите личинку спинной стороной вверх в каплю PBS на посуду, покрытую силиконом. На тыльной стороне находятся две трахеальные трубки.

Под препарирующим микроскопом с помощью щипцов вставьте булавку от насекомых в передний кончик. Затем вытяните корпус к задней стороне и вставьте второй штифт в задний кончик. Далее сделайте небольшой надрез возле хвоста с помощью микроножниц.

От разреза осторожно разрежьте тыльную сторону кутикулы в продольном направлении по спинной средней линии, по направлению к головке, при этом не повредив ни одной из тканей под кутикулой. После того, как сделан надрез, растяните стенки тела, а по углам закрепите их булавками от насекомых. Затем с помощью щипцов удаляют переднее жировое тело и слюнные железы, обнажая таким образом комплекс мозговых кольцевых желез на поверхности.

Теперь аспирируйте PBS, и погрузите препарат в фиксирующий раствор. Через 30 минут с помощью щипцов удалите булавки от насекомых и перенесите препарат в микротрубку, заполненную 0,3% ПБТ. Затем приступайте к иммуноокрашиванию.

После иммуноокрашивания личинок с помощью одноразовой пипетки перенесите образцы в чашку, наполненную 0,3% ПБТ. Под препарирующим микроскопом захватите кутикулу или крючок для рта одной парой щипцов. Затем с помощью иглы 27 калибра, прикрепленной к одномиллилилитровому шприцу, как ножу, удалите комплекс глазного диска головного мозга из кутикулы тела, отрезав передний кончик пищевода и глазные диски.

Далее с помощью щипцов аккуратно отделите пищевод и кишку от комплекса мозгового кольцевого диска глаза. Вытяните кишку в заднюю сторону, так как пищевод проходит через мозг над вентральным нервным канатиком. Наконец, чтобы изолировать комплекс мозговой и кольцевой желез, аккуратно разрежьте соединения между мозговым диском, глазными дисками и дисками ног с помощью игольчатого ножа.

При рассечении очень важно использовать тонкие щипцы с острыми краями. Я настоятельно рекомендую затачивать щипцы куском шлифовального камня, чтобы соединить их края без каких-либо зазоров. Для переноса образцов используйте микропипетку с широким наконечником.

Поместите образцы на центр предметного стекла. Затем с помощью щипцов расположите образцы на их вентральных сторонах, чтобы можно было визуализировать кольцевую железу, расположенную на дорсальной стороне мозга. Далее наклоните предметное стекло и сотрите как можно больше излишков ПБТ.

Затем положите каплю монтажного реактива рядом с образцами и с помощью щипцов медленно опустите покровное стекло над реагентом, а затем над образцами. Чтобы препарировать яичник взрослой самки, обезболите мух углекислым газом. Затем отрубите им головы и перенесите их тела в трехсантиметровую тарелку, наполненную PBS.

Далее под рассекающим микроскопом обхватите щипцами тыльную сторону грудной клетки, а второй парой щипцов возьмитесь за брюшной сегмент А-5 или А-6. Затем отклейте кутикулу живота к задней стороне. Прежде чем продолжить, счистите липкую кутикулу с щипцов.

Далее прищипывают яйцевод, и изолируют завязь. Затем вычесать и разложить кончики яичников с помощью щипцов. После нанесения погрузите яичники в фиксирующий раствор на 30 минут, чтобы подготовить их к окрашиванию.

Чтобы приготовить препарат, поддерживающий иннервацию яичника, перенесите обезболенных самок мух в посуду, покрытую силиконом, наполненную PBS. Под микроскопом вскрытия возьмите хоботок и снимите кутикулу головы, чтобы обнажить мозг. Из головного мозга удалите прикрепленную трахею, оставив мозг соединенным с вентральным нервным канатиком.

Затем возьмитесь за грудную клетку за спинную сторону, а ноги и крылья удалите. Затем снимите кожуру с вентральной кутикулы грудной клетки, начиная с основания каждой ноги. После того, как VNC обнажена, очень осторожно удалите остаточную тыльную кутикулу и мышцы, прикрепленные к VNC, с помощью щипцов.

Не повреждайте связи между мозгом и VNC. Затем с помощью щипцов отклейте кутикулу живота, чтобы обнажить яичники и их взаимодействующие органы, включая опору, кишечник, овец, матку и добавочную железу. Наконец, удалите все остаточные ткани, включая трахею и жировое тело.

Затем погрузите образцы в фиксирующий раствор на 30 минут, чтобы подготовить их к иммуноокрашиванию. После иммуноокрашивания перенесите образцы на предметное стекло с 0,1% PBT с помощью микропипетки. Затем просмотрите предметное стекло с помощью микроскопа, и отделите нити овариолов друг от друга с помощью щипцов.

Не травмируйте кончики овариолов во время этого процесса. В них содержатся гермарии. При подготовке мозга к комплексу репродуктивных органов удалите остатки кутикулы и разложите структуры на предметном стекле.

Далее сотрите большую часть излишков ПБТ, а затем нанесите на образец каплю монтажного реагента. Затем медленно наденьте на предметное стекло с помощью щипцов чехол и храните предметное стекло при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. Позже рассмотрите образцы под микроскопом, и выведите в поле зрения стероидогенные органы.

После того, как изображение будет зафиксировано, переключите систему обработки изображений в режим получения изображений. На личиночных стадиях переднегрудная железа была помечена антителами против экдистероидогенных ферментов, в том числе антителом против оболочки. Чтобы визуализировать нейронную связь между переднегрудной железой и мозгом, был рассечен комплекс мозг-кольцевая железа.

Метод филевидной диссекции показывает умиротворяющую нервную систему, в которой группа серотонинергических нейронов проецируется на переднегрудную железу, провентрикулус и мышцы глотки. У взрослых женщин экдистероиды яичников влияют на многие аспекты овогенеза, такие как пролиферация GSC. ГСК расположены в гермариозе на кончике каждого овариола в яичнике.

В гермарии ГСК были специфически помечены с использованием двух антител, 1B1 и DE-кадгерина. Чтобы визуализировать иннервацию яичника, яичник был рассечен вместе с мозгом, VNC, кишечником, опорой, маткой и сперматекой. Нейроны визуализировались с помощью mCD8:GFP под контролем драйвера n-Synaptobrevin GAL4.

Кроме того, мышечную структуру окрашивали с помощью диконъюгированного фаллоидина. Хотя вскрытие стероидогенных органов поначалу может показаться сложным, используйте этот фильм, чтобы узнать точку разреза тканей, чтобы легче изолировать орган без травм. Мы надеемся, что наш протокол будет информативным не только для начинающих, но и для опытных исследователей.

Как только вы освоите эту процедуру, вы сможете применить ее в своих исследованиях и освежить ее в соответствии со своими потребностями. Мы надеемся, что этот протокол поможет всестороннему пониманию биосинтеза стероидных гормонов. Более подробные пошаговые протоколы доступны в рукописи.

Пожалуйста, ознакомьтесь с этим.