Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у
25 мая 2017 г.
Этот протокол демонстрирует основанный на флуоресценции метод для визуализации сосудистой сети и для количественной оценки ее сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды можно визуализировать через несколько минут после введения флуоресцентного красителя в сердцебиение эмбриона после генетических и / или фармакологических манипуляций для исследования сердечно-сосудистого развития in vivo .
Общая цель данной процедуры — визуализация сосудистой сети головастиков Xenopus tropicalis. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистой биологии, например, о механизмах регуляции ангиогенеза. Основным преимуществом данной методики является то, что кровеносные сосуды в интактном эмбрионе, находящемся в лунке, могут быть визуализированы путем простого введения флуоресцентного красителя.
Начните с заполнения конической стеклянной микропипетки с помощью микрозагрузчика примерно пятью микролитрами прозрачного раствора ацетилированного LDL с diI, следя за тем, чтобы в пипетку не попали осажденные частицы. Под стереомикроскопом используйте тонкий пинцет № 55, чтобы обрезать кончик пипетки для регулировки объема загруженного комплекса, и настройте систему инъекций с контролем давления на введение примерно пяти нанолитров раствора за одну инъекцию. Затем погрузите кончик пипетки в 0,04% MS-222 в 0,1X модифицированном растворе Барта (MBS) в специально изготовленной форме из Sylgard.
Затем перенесите эмбрион Xenopus tropicalis в форму Sylgard и убедитесь в полной седации по отсутствию реакции на стимуляцию спинного плавника. Под диссекционным микроскопом поместите эмбрион брюшной стороной вверх в V-образное углубление формы, расположив его слегка под наклоном. Плотно закрепите две миниатюрные булавки диаметром 0,1 мм в держателе и с помощью одной булавки проколите кожу над сердцем, которое должно заметно пульсировать.
Вставьте булавку через отверстие в пространстве между сердцем и кожей, не прокалывая сердце, и расположите введенный кончик в области предполагаемого разреза. Затем проведите второй булавкой вдоль введенной, чтобы сделать линейный разрез, и с помощью обеих булавок осторожно расширьте разрез, обнажив сердце. Для введения раствора DiI-ацетилированного LDL вставьте наконечник стеклянной пипетки в сердце и введите от 50 до 60 nano liters DiI-ацетилированного LDL примерно за 10 импульсов выталкивания.
После введения всего объема раствора красителя убедитесь, что сердце по-прежнему бьется, и перенесите эмбрион в новую чашку Петри с 0,1X MBS. Через 5–10 минут головастик должен выйти из состояния анестезии и начать двигаться. После инъекций соответствующему количеству эмбрионов проведите визуальный скрининг правильно помеченных анестезированных эмбрионов под флуоресцентным микроскопом, отбраковав животных с метками в других органах.
Эмбрионы с недостаточной маркировкой можно подвергнуть повторному инъектированию. Затем следует получить изображения правильно маркированных эмбрионов. Для более детальной визуализации кровеносных сосудов повторно анестезированных эмбрионов фиксируют в 4% параформальдегиде в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте для последующего исследования методом конфокальной микроскопии.
При введении в сердце достаточного количества ацетилированного LDL, меченного diI, задняя кардинальная вена (PCV) должна стать сразу видна под флуоресцентным микроскопом. Межсомитные вены (ISV) отходят дорсально от PCV волной в передне-заднем направлении, начиная со стадии 36 и заканчивая примерно 40–41 стадией, приобретая легкое ветвление около 43 стадии. PCV и ISV растут по стереотипному ангиогенному паттерну, который находится под строгим регуляторным контролем в процессе развития.
Интересно, что нокдаун сигналинга TIE-2 с помощью антисмысловых морфолино decreases длину и сложность ISV, в то время как экспрессия конститутивно активной формы TIE-2 вызывает избыточное ветвление ISV. Для оценки сложности ISV может быть рассчитан индекс сложности вен (Vein Complexity Index), а для визуализации общей архитектуры эмбриональной сосудистой сети Xenopus tropicalis могут быть созданы рендерируемые пути. Оригинальный протокол для Xenopus laevis был описан Левином и Коликс (Levin and Colics), и мы адаптировали его для Xenopus tropicalis.
При должном навыке эта техника может быть выполнена за один час при условии правильного соблюдения протокола. Перед данной процедурой можно провести генетические и фармакологические манипуляции для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о том, какие гены и сигнальные пути регулируют развитие сосудов. С помощью данной процедуры можно визуализировать меченную сосудистую сеть в режиме реального времени в живом организме, что представляет собой мощный инструмент для исследования динамики развития сосудов.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вводить диI-ацетилированный LDL в сердце головастика Xenopus tropicalis для визуализации его сосудистой системы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод визуализации сосудов и количественной оценки их сложности у Xenopus tropicalis с использованием флуоресценции. Этот метод позволяет получать изображения кровеносных сосудов вскоре после введения флуоресцентного красителя в сердце эмбриона, что облегчает изучение развития сердечно-сосудистой системы in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология сердечно-сосудистой системы
- Ангиогенез
- Биология развития
Теоретическая часть
- Xenopus tropicalis является модельным организмом для изучения развития позвоночных.
- Понимание развития сосудов имеет решающее значение для изучения различных заболеваний.
- Методы флуоресцентной визуализации улучшают визуализацию биологических структур.
- Данный метод позволяет наблюдать за изменениями сосудов в режиме реального времени.
Цель исследования
- Визуализация сосудистой сети головастиков Xenopus tropicalis.
- Изучение регуляции ангиогенеза.
- Предложение простого и эффективного метода исследования развития сердечно-сосудистой системы.
Используемые методы
- Инъекция флуоресцентного красителя в сердце эмбриона.
- Использование микрозагрузчика и конической стеклянной микропипетки для точного введения красителя.
- Визуализация кровеносных сосудов с помощью диссекционного микроскопа.
- Применение генетических и фармакологических манипуляций для изучения их влияния на сосудистую систему.
Основные результаты
- Успешная визуализация кровеносных сосудов в интактных эмбрионах.
- Количественная оценка сложности сосудистой сети, полученная с помощью визуализации.
- Получение данных о динамике развития сердечно-сосудистой системы.
- Продемонстрированная эффективность метода инъекции флуоресцентного красителя.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения развития сосудов.
- Флуоресцентная визуализация является мощным инструментом для анализа в режиме реального времени.
- Этот подход может способствовать дальнейшим исследованиям в области биологии сердечно-сосудистой системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет осуществлять прямую визуализацию и количественную оценку сложности сосудистой сети на модели позвоночных, что способствует валидации мишеней на ранних стадиях исследования путей ангиогенеза. Обеспечивая получение количественных данных о прорастании и ветвлении сосудов, этот подход позволяет снизить механистические риски при выборе сосудистых мишеней перед переходом к этапам идентификации ведущих соединений. Система на базе Xenopus tropicalis представляет собой релевантную с точки зрения патологии платформу для оценки ангиогенных фенотипов с высокой прогностической достоверностью в доклинических сердечно-сосудистых исследованиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы относительно ангиогенных регуляторов, таких как сигнализация TIE-2, посредством прямого наблюдения за паттернами прорастания сосудов.
- Практическая ценность: обеспечивает быстрый недельный рабочий процесс для оценки влияния генов или сигнальных путей на развитие сосудов без необходимости использования генетически модифицированных моделей.
- Прогностическая ценность: количественные показатели, такие как индекс сложности вен (Vein Complexity Index), позволяют объективно оценить эффекты модуляции мишеней для принятия решений по сортировке портфеля препаратов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое мечение сосудов, совместимое с последующими этапами визуализации и анализа.
- Количественные показатели: позволяет измерять длину межсомитных вен и сложность ветвления в качестве дозозависимых показателей для скрининга соединений.
- Масштабируемость: простая процедура инъекции красителя и визуализации поддерживает оценку фармакологических или генетических воздействий со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует стереотипный ангиогенез у Xenopus tropicalis, позволяя глубже понять пути развития сосудистой системы человека.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты ранних открытий с доклинической валидацией через консервативные механизмы ангиогенеза.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет быстро тестировать модуляторы сигнальных путей для уточнения биологии мишени перед переходом к исследованиям на моделях млекопитающих.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум исследований: от проверки гипотезы о мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя данные о сосудистом фенотипе, которые позволяют принимать решения о целесообразности дальнейшего развития программ, направленных на изучение ангиогенеза.
- Открытие биологических механизмов: способствует уточнению сигнальных путей путем установления связи между генетическими или фармакологическими воздействиями и количественными изменениями сосудистой архитектуры.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые результаты на основе визуализации, подходящие для оценки влияния соединений на ангиогенное прорастание.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели сложности сосудистой сети, что позволяет проводить объективное сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: использует консервативные механизмы ангиогенеза для обеспечения преемственности между эмбриональными моделями и сосудистыми системами млекопитающих.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для фенотипирования сосудов, применимую в нескольких проектах по исследованию мишеней ангиогенеза.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации ангиогенных мишеней за счет прямой количественной визуализации сосудистых сетей.
- Практическая ценность: Стандартизирует оценку сосудов посредством простого введения красителя и воспроизводимой визуализации, что минимизирует вариативность между экспериментами.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски, связанные с сосудистыми мишенями, что уменьшает вероятность неудач на поздних стадиях реализации кардиоваскулярных программ.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию модификаторов ангиогенеза с учетом рисков на основе количественных фенотипических результатов.
Особенности реализации
- Требуется опыт применения микрохирургических методов манипулирования эмбрионами и проведения сердечных микроинъекций.
- Результат зависит от наличия инфраструктуры флуоресцентной микроскопии для визуализации сосудов и захвата изображений.
- Необходима стандартизация стадий развития эмбрионов и времени проведения инъекций для обеспечения единообразной маркировки сосудов.
- При распространении полученных данных на другие модельные системы или контексты клинической значимости для человека требуются адаптационные корректировки.
- Практические ограничения включают зависимость от доступности эмбрионов и необходимость тщательной оптимизации концентрации красителя во избежание неспецифического окрашивания.
