Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у Xenopus tropicalis

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации сосудистой сети головастиков Xenopus tropicalis. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии сердечно-сосудистых заболеваний, такие как регулирование ангиогенеза. Основное преимущество этой методики заключается в том, что кровеносные сосуды в неповрежденном эмбрионе хорошо могут быть визуализированы с помощью простой инъекции флуоресцентного красителя.

Начните с использования микрозагрузчика, чтобы наполнить микропипетку из конического стекла примерно пятью микролитрами прозрачного ацетилированного раствора ЛПНП, следя за тем, чтобы в него не попадали осажденные частицы. Под препарирующим микроскопом с помощью тонкой пары щипцов номер 55 зажимите кончик пипетки, чтобы отрегулировать объем загружаемого комплекса и настроить систему впрыска с контролируемым давлением на выброс примерно пяти нанолитров раствора за одну инъекцию. Затем погрузите наконечник пипетки в 0,04% MS-222 в модифицированный физиологический раствор Барта 0,1X или MBS в специально изготовленную форму Sylgard.

Затем перенесите эмбрион Xenopus tropicalis в плесень Sylgard и подтвердите полную седацию с отсутствием реакции на стимуляцию спинного плавника. Под рассекающий микроскоп загрузите вентральную сторону эмбриона вверх в V-образное углубление формы в слегка косом положении. Плотно прикрепите два штифта диаметром 0,1 мм к держателю булавки и одним булавкой проколите кожу над сердцем, которая должна заметно пульсировать.

Вставьте штифт через отверстие в пространстве между сердцем и кожей, не прокалывая сердце, и расположите введенный наконечник в области, где будет сделан разрез. Затем потрите второй штифт о вставленный штифт, чтобы сделать линейный разрез, и используйте оба штифта вместе, чтобы аккуратно расширить разрез, обнажив сердце. Чтобы ввести раствор ацетилированного ЛПНП DiI, вставьте стеклянный наконечник пипетки в сердце и введите от 50 до 60 нанолитров ацетилированного ЛПНП DiI примерно за 10 импульсов выброса.

Когда весь раствор красителя будет доставлен, убедитесь, что сердце все еще бьется, и перенесите эмбрион в новую чашку Петри, содержащую 0,1X MBS. Через пять-10 минут головастик должен прийти в себя после наркоза и начать двигаться. После того, как было введено соответствующее количество эмбрионов, визуально проведите визуальный скрининг правильно помеченных обезболиваемых эмбрионов под флуоресцентным микроскопом, отбросив всех животных, у которых помечены другие органы.

Эмбрионы, которые были недостаточно помечены, могут быть введены повторно. Затем сделайте снимки правильно помеченных эмбрионов. Для более тщательной визуализации кровеносных сосудов зафиксируйте обезболенные эмбрионы в 4% параформальдегиде в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света, для визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

Если в сердце вводится достаточное количество диI ацетилированного ЛПНП, задняя кардинальная вена, или ПКВ, должна быть немедленно видна под флуоресцентным микроскопом. Межсомитные вены, или ISV, выходят дорсально из ПКВ в виде передней и задней волны, начиная со стадии 36 и заканчивая примерно стадией с 40 по 41, становясь слегка разветвленными около стадии 43. ПКВ и ПОВ развиваются по стереотипной ангиогенной схеме, которая находится под жестким контролем развития.

Интересно, что подавление передачи сигналов TIE-2 антисмысловыми морфалино уменьшает длину и сложность ISV, в то время как экспрессия конститутивно активной формы TIE-2 вызывает чрезмерное ветвление ISV. Индекс сложности вен может быть рассчитан для оценки сложности независимых поставщиков ПО, а визуализированные пути могут быть сгенерированы для визуализации общей архитектуры эмбриональной сосудистой сети Xenopus tropicalis. Оригинальный протокол был описан для использования Xenopus laevis Левином и Коликсом, и мы адаптировали его для Xenopus tropicalis.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. Перед этой процедурой могут быть проведены генетические и фармакологические манипуляции, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены и сигнальные пути регулируют развитие сосудов. С помощью этой процедуры меченая сосудистая сеть может быть визуализирована у интактного животного в режиме реального времени, что является мощным инструментом для исследования динамики развития сосудов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вводить диI ацетилированный ЛПНП в сердце головастика Xenopus tropicalis для визуализации его сосудистой системы.