Dissection, культуры и анализ
23 декабря 2012 г.
Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.
Общая цель данной процедуры — получение первичной культуры клеток сетчатки xenopus. Для этого сначала удаляют окружающие ткани, чтобы обнажить сетчатку. На втором этапе производится иссечение ткани сетчатки.
Затем ткань сетчатки диссоциируют до состояния одиночных клеток. Заключительным этапом является высев клеток сетчатки в чашку UnCloned и добавление flu oh 4:00 AM для визуализации кальция. В конечном итоге для обнаружения кальциевой активности в культуре клеток сетчатки используется конфокальная микроскопия.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, нейробиологии и клеточной биологии, такие как роль кальция и электрической активности в развитии сетчатки, а также экспрессия генов на уровне отдельных клеток. Как правило, лицам, впервые выполняющим данную процедуру, будет сложно справиться с ней, поскольку для своевременного и точного препарирования необходима развитая мелкая моторика. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы препарирования затруднены из-за необходимости выполнения сложных скоординированных движений рук и глаз.
Для начала данной процедуры внутри вытяжного шкафа подготовьте и промаркируйте следующее: одну пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 10 мл среды для культивирования клеток, которая будет использоваться в качестве планшета для диссекции. Опционально в планшет для диссекции можно добавить 10 мг коллагеназы B до конечной концентрации 1,0 мг/мл, чтобы облегчить разделение слоев ткани при диссекции эмбрионов стадии 25 или более ранних.
Также подготовьте одну 35-миллиметровую чашку для культивирования, содержащую 2 мл среды для культивирования клеток, которая будет использоваться в качестве культуральной пластины; одну пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, которая будет использоваться в качестве пробирки для диссоциации эксплантата, и одну коническую пробирку Falcon объемом 15 мл, содержащую 15 мл среды.
Среда для культивирования клеток. Затем подготовьте две пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие по 2 мл CMF для диссекции: одну для использования в качестве планшета для диссоциации экспланта, другую — для промывки экспланта вне вытяжного шкафа. Подготовьте две пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм, содержащие по 10 мл.
0,1 XMMR, одна будет использоваться в качестве удерживающей пластины, другая — в качестве сиблинг-пластины, а также еще одна пластиковая чашка Петри диаметром 60 миллиметров, содержащая 10 миллилитров 0,1 XMMR плюс 0,5 миллиграмм на миллилитр MS 2 22. После этого добавьте 40 микролитров 5% трипсина в CMF в пластину для диссоциации эксплантатов.
Перемешайте содержимое круговыми движениями, затем отставьте в сторону. Далее приступайте к диссекции под диссекционным микроскопом, используя два пары тонких пинцетов. Сделайте срединный сагиттальный разрез на вентральной стороне эмбриона, начиная с заднего конца и продолжая через цементную железу в передней части эмбриона.
Осторожно раскройте эмбрион, раздвигая края разреза в обе стороны. В результате дорсальная сторона эмбриона окажется обращена к предметному стеклу. Затем раскройте вентральную эктодерму, чтобы обнажить энтодерму и мезодерму.
Затем удалите энтодерму и мезодерму — первый и самый крупный слой этой ткани. Энтодерма выглядит очень рыхлой, состоит из крупных клеток и практически не имеет явной организации. После удаления этого слоя станут видны сомиты и хорда.
Для улучшения контрастности перенесите эмбрион в отдельную пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 10 мл среды для культивирования клеток и 100 µL 1% раствора сульфата нильского синего, и инкубируйте в течение двух-трех минут. После этого верните его на препарировочную пластину. Это позволит окрасить эктодерму, сомиты и хорду для более легкой идентификации и ориентации.
Сконцентрируйтесь на передней части эмбриона, осторожно удалите хорион и остатки мезодермы, чтобы обнажить головной мозг и оптические пузыри. После того как головной мозг и оптические пузыри будут полностью обнажены, с помощью пинцета перережьте нервную трубку и подлежащую эктодерму сразу позади головного мозга. Переверните эту часть так, чтобы эктодерма оказалась сверху.
Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить подлежащие оптические пузыри, и аккуратно удалите эктодерму. В завершение, используя пинцет, отделите оптические пузыри от мозга, если диссекция проводится на эмбрионе старше стадии 25. Сначала удалите вентральную часть эмбриона с помощью пинцета, находясь на планшете для анестезии.
Для обеспечения лучшего контраста перенесите эмбрион в пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 10 мл 0,1 XMMR и 100 мкл 1% нил синего сульфата, на две-три минуты для окрашивания эктодермы. Затем перенесите его на предметное стекло для диссекции. После этого, фиксируя эмбрион, осторожно удалите сетчатку или оптический пузырь, расположенные непосредственно под вышележащей эктодермой.
После препарирования оптического пузыря или сетчатки осторожно перенесите их на промывочную пластину X с помощью микропипетки P 100 с наконечником с фильтром. Будьте осторожны, чтобы эксплантат не касался границы раздела фаз воздух-жидкость. Затем оставьте эксплантат на 30 секунд.
Затем перенесите 80 µL 0,1% трипсина в CMF из планшета для диссоциации экспланта в пробирку для диссоциации экспланта. После этого перенесите сетчатку или оптический пузырек из планшета для промывки экспланта в пробирку для диссоциации экспланта, стараясь не переносить раствор для промывки экспланта.
Затем оставьте ткань для диссоциации в пробирке для диссоциации эксплантов на один час при комнатной температуре. Если в ходе эксперимента планируется сделать несколько снимков клеток, прикрепите сетку к нижней стороне культуральной чашки с помощью небольших капель суперклея. Это позволит делать снимки одних и тех же клеток в одинаковой ориентации на разных этапах процедуры высева клеток.
Сначала медленно удалите 40 µL раствора из пробирки с диссоциированным эксплантом и утилизируйте его. Затем с помощью дозатора P 100 с наконечником с фильтром медленно перенесите клетки в культуральную чашку. При нанесении клеток в чашку пипетируйте медленно, располагая клетки на небольшой площади в центре чашки.
На данном рисунке представлен пример активности кальция в одной клетке в течение одного часа визуализации. Эти рисунки содержат репрезентативные результаты экспериментов по кальциевому имиджингу в клетках эмбриональной сетчатки, проанализированные на разных стадиях развития. Вкратце, результаты показывают, что активность кальция регулируется в процессе развития, с пикообразными всплесками на стадии 35 при сопоставлении активности кальция с клетками, положительными по специфическому зонду.
В экспериментах на рыбах, несмотря на отсутствие статистически значимых различий, наблюдалась тенденция к тому, что клетки, положительные по ГАМК-ергическому маркеру, проявляли более высокий уровень кальциевых спайков, чем клетки, положительные по глутаматергическому маркеру или по экспрессии гена PT F1 A.A, кодирующего транскрипционный фактор, связанный с promoting GABAergic phenotype. После освоения данная методика занимает около 3 часов 30 минут для одной планшетки при условии правильного выполнения. После проведения этой процедуры для поиска ответов на дополнительные вопросы — например, о том, какие клетки экспрессируют специфические фенотипические маркеры, или для анализа электрофизиологических показателей — могут быть использованы другие методы, такие как культивирование клеток, C two гибридизация или электрофизиологическая регистрация. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить препарирование тканей сетчатки, диссоциацию тканей сетчатки и посев клеток сетчатки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика подготовки первичных культур клеток сетчатки глаза Xenopus laevis. Метод включает в себя выделение тканей сетчатки, их диссоциацию до отдельных клеток и визуализацию кальциевой активности с помощью конфокальной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Физиология
Введение
- Xenopus laevis является ценной моделью для изучения клеток сетчатки.
- Понимание спецификации судьбы клеток имеет решающее значение для биологии развития.
- Кальциевый имиджинг позволяет получить представление о клеточной активности.
- Гибридизация in situ позволяет проводить анализ экспрессии генов.
Цель исследования
- Разработка надежного метода культивирования клеток сетчатки.
- Анализ кальциевой активности в культурах клеток сетчатки.
- Углубление понимания физиологии клеток сетчатки.
Используемые методы
- Препарирование тканей сетчатки Xenopus laevis.
- Диссоциация ткани сетчатки до состояния отдельных клеток.
- Посев клеток сетчатки в чашку UnCloned.
- Кальциевый имиджинг с использованием конфокальной микроскопии.
Основные результаты
- Успешное получение первичных культур клеток из тканей сетчатки.
- Эффективная визуализация кальциевой активности в культивируемых клетках сетчатки.
- Демонстрация гибридизации in situ для анализа экспрессии генов.
Выводы
- Данная методика представляет собой надежную модель для изучения физиологии клеток сетчатки.
- Кальциевый имиджинг является ценным инструментом для оценки клеточной активности.
- Этот метод может способствовать дальнейшим исследованиям в области биологии сетчатки.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Первичная культура клеток ретинальной ткани Xenopus laevis позволяет детально изучить механизмы работы путей сигнального развития и спецификации клеточных судеб на генетически доступной модели позвоночных. Данный подход облегчает валидацию мишеней, позволяя напрямую наблюдать динамику кальция и экспрессию генов с разрешением до одной клетки, что снижает неопределенность при проверке гипотез на ранних этапах. Этот метод представляет собой масштабируемую и воспроизводимую систему для снижения рисков при изучении биологических мишеней сетчатки перед переходом к трансляционным исследованиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить функциональную валидацию спецификации клеток сетчатки с помощью анализа активности кальция и экспрессии генов.
- Практическая ценность: обеспечивает определенную безсывороточную систему культивирования, которая сводит к минимуму влияние мешающих переменных при первичной оценке мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует механистическому снижению рисков путем установления связи между молекулярными нарушениями и фенотипическими результатами в развивающихся клетках сетчатки.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение очищенных популяций клеток сетчатки, подходящих для высококонтентного имиджинга и скрининга лигандов.
- Количественные показатели: позволяет измерять частоту и амплитуду транзиентов кальция в качестве функциональных биомаркеров созревания нейронов.
- Воспроизводимость: стандартизированные протоколы диссекции и диссоциации обеспечивают стабильный выход клеток в различных экспериментах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Позволяет фиксировать ранние процессы нейроразвития сетчатки, консервативные для всех позвоночных, что дает информацию для создания моделей врожденных нарушений сетчатки.
- Сопоставление с биомаркерами: Позволяет коррелировать паттерны кальциевой сигнализации со специфическими для типов клеток маркерами (например, ГАМК-эргическими, глутаматергическими) для исследований по изучению взаимодействия с мишенями.
- Доклиническая преемственность: Связывает механизмы развития in vivo с валидацией in vitro, что обосновывает решения о продвижении разработок с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на этапе фундаментальных биологических исследований, позволяя проводить поиск гипотез в области физиологии клеток сетчатки перед переходом к идентификации ведущих соединений или запуском доклинических программ.
- Открывающая биология: Облегчает изучение путей развития и нейрональной дифференциации с помощью визуализации кальция в живых клетках и молекулярного профилирования.
- Скрининг: Подготовка стандартизированных культур клеток сетчатки для исследований по воздействию соединений и валидации функционального отклика.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные с разрешением до одной клетки о кальциевой активности и экспрессии генов для проведения сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает механизмы раннего развития с потенциальными терапевтическими мишенями при дегенерации сетчатки.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения типов клеток сетчатки в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет снижения механистической неопределенности при определении судьбы клеток сетчатки.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость за счет стандартизированных рабочих процессов диссекции и диссоциации тканей.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем обеспечения ранней функциональной валидации мишеней в системе, релевантной для данного заболевания.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней биологии сетчатки с учетом рисков на основе фенотипических данных и данных о передаче сигналов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургической диссекции и стерильного обращения с тканями.
- Зависимость от точности инструментов, включая диссекционный микроскоп, микроинъекторы и установку для конфокальной микроскопии.
- Необходимость стандартизированного приготовления реагентов (например, коллагеназы B, трипсина, сульфата нил-синего) для обеспечения стабильной диссоциации тканей.
- Учет особенностей адаптации для различных стадий развития Xenopus в связи с изменениями размера и адгезии тканей.
- Практическое ограничение: пропускная способность при ручной диссекции ограничена необходимостью точного моторного контроля и визуального контроля.
