Dissection, культуры и анализ Xenopus Хепориз Эмбриональные ткани сетчатки

Общей целью этой процедуры является получение первичной клеточной культуры клеток сетчатки xenopus. Это достигается путем удаления окружающих тканей, чтобы обнажить сетчатку. Второй шаг – иссечение ткани сетчатки.

Далее ткань сетчатки диссоциируется на отдельные клетки. Последний шаг заключается в том, чтобы поместить клетки сетчатки на чашку UnCloned и добавить flu oh 4:00 AM для визуализации кальция. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для определения активности кальция в культуре клеток сетчатки.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, нейробиологии и клеточной биологии, такие как роль кальция и электрической активности в развитии сетчатки, а также экспрессия генов на уровне одной клетки. Как правило, люди, плохо знакомые с этой процедурой, испытывают трудности, потому что для своевременного и точного вскрытия необходимы мелкая моторика. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы вскрытия сложны, потому что необходимы сложные движения рук и глаз.

Чтобы начать эту процедуру внутри вытяжки, подготовьте и промаркируйте следующее, одну 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров. Среду для культивирования клеток использовать в качестве диссекционной пластины. Необязательно, 10 мг коллагеназы В могут быть добавлены в диссекционный планшет для получения конечной концентрации 1,0 мг на миллилитр, чтобы помочь в разделении слоев ткани при препарировании эмбрионов на стадии 25 лет или младше.

Также приготовьте 1 35 миллиметровую поверхность посуды, содержащую два миллилитра. Среду для культивирования клеток использовать в качестве культивальной тарелки. Одна пустая микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 миллилитра для использования в качестве экспланной диссоциационной трубки и одна коническая пробирка сокола объемом 15 миллилитров, содержащая 15 миллилитров.

Среда для культивирования клеток. Затем приготовьте 2 35-миллиметровые пластиковые чашки Петри, содержащие два миллилитра, CMF для препарирования, одну для использования в качестве расширительной диссоциационной пластины, другую в качестве X для полоскания снаружи вытяжки. Приготовьте две 60-миллиметровые пластиковые чашки Петри, содержащие 10 миллилитров.

0,1 XMMR, одна из которых должна использоваться в качестве удерживающей пластины, другая — в качестве родственной пластины, и еще одна 60-миллиметровая пластиковая чашка Петри, содержащая 10 миллилитров, 0,1 XMMR плюс 0,5 миллиграмма на миллилитр. МС 2 22. После этого добавьте в экспланную диссоциационную пластину 40 микролитров, 5%-ный трипцин в CMF.

Перемешайте, затем отложите в сторону. Далее приступайте к рассечению с помощью рассекающего эндоскопа, используя две пары тонких щипцов. Сделайте средний сагиттальный надрез на вентральной стороне эмбриона, начиная с заднего конца и продолжая через цементную железу в передней части эмбриона.

Осторожно раскройте зародыш, разложив по обеим сторонам среза. В результате дорсальная сторона эмбриона оказывается обращенной к пластине для вскрытия. Затем откройте вентральную эктодерму, чтобы открыть энтодерму и мезодерму.

Далее удаляют из энтодермы и мезодермы первый и самый большой слой этой ткани. Энтодерма очень пушистая на вид с крупными клетками и мало выраженной организацией. После удаления этого слоя сомиты и Нур станут видимыми.

Для лучшего контраста перенесите эмбрион в отдельную 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров клеточной питательной среды и 100 микролитров 1%-ного раствора сульфата нильского синего и инкубируйте в течение двух-трех минут. После этого перенесите его обратно на пластину для препарирования. Это окрашивает эктодерму, сомиты и нур для более легкой идентификации и ориентации.

Сосредоточившись на передней части эмбриона, осторожно удалите Нур и оставшуюся мезодерму, чтобы обнажить мозг и зрительные пузырьки. После того, как мозг и зрительные пузырьки полностью обнажены, используйте щипцы, чтобы разорвать нервную трубку и нижележащую эктодерму, расположенную сразу за мозгом. Переверните эту порцию так, чтобы эктодерма оказалась сверху.

Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить нижележащие зрительные пузырьки, и осторожно удалите эктодерму. Наконец, отделите зрительные пузырьки от мозга с помощью щипцов, чтобы препарировать эмбрион старше 25 стадии. Сначала удалите вентральную часть эмбриона с помощью щипцов в анестезиологической пластине.

Для лучшего контраста перенесите эмбрион в 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров, 0,1 XMMR и 100 микролитров 1% сульфата нильского синего на две-три минуты, чтобы окрашивать эктодерму. Затем перенесите его на пластину для препарирования. Затем, удерживая эмбрион на месте, осторожно удалите сетчатку или зрительные пузырьки, которые лежат непосредственно под перекрывающейся эктодермой.

После того, как зрительный пузырь или сетчатка будут рассечены, осторожно перенесите их на полоскательную пластину X explan с помощью микропипетки P 100 с помощью наконечника, устойчивого к аэрозолям. Будьте осторожны, не допускайте соприкосновения с границами воздушной жидкости. Затем дайте эксплану постоять 30 секунд.

Далее переведите 80 микролитров 0,1%-ного трипсина в CMF из экспланной диссоциационной пластины в экспланную диссоциационную трубку. После этого перенесите сетчатку или зрительный пузырь из полоскательной пластины explan в диссоциационную трубку explan. Избегайте переноса раствора для полоскания explan.

Затем дайте ткани диссоциировать в эксплановой диссоциационной трубке в течение одного часа при комнатной температуре. Если в ходе эксперимента необходимо сделать несколько изображений клеток, прикрепите сетку к нижней стороне планшета с помощью небольших капель суперклея. Это позволит получать изображения идентичных клеток в идентичных ориентациях в разных точках процедуры нанесения пластин на клетки.

Сначала медленно удалите 40 микролитров раствора из экспланной диссоциационной пробирки и выбросьте. Затем используйте P 100 с устойчивым к аэрозолям наконечником, чтобы медленно перенести клетки на культуральную пластину. При отсасывании клеток на планшет делайте пипетку медленно и удерживайте клетки на небольшой площади в центре планшета.

На этом рисунке показан пример активности кальция в одной клетке в течение одного часа визуализации. Эти рисунки представляют собой репрезентативные результаты экспериментов по визуализации кальция в эмбриональных клетках сетчатки, проанализированных на разных стадиях развития. Вкратце, результаты показывают, что кальций регулируется в процессе развития с пиками на 35-й стадии с точки зрения корреляции активности кальция с клетками, положительными для конкретного зонда.

В экспериментах на рыбах, несмотря на отсутствие статистически значимых различий, наблюдалась тенденция к тому, что клетки, положительные на ГАМКергический маркер, демонстрировали более высокие уровни активности кальциевого спайка, чем клетки, положительные на глутаматергический маркер или на кодирование гена PT F1 A.A, транскрипционный фактор, коррелировавший с продвижением ГАМКергического фенотипа. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как культивирование клеток и гибридизация С-2 или электрофизиологические записи, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как то, какие клетки экспрессируют специфические фенотипические маркеры, или для анализа электрофизиологических записей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать ткань сетчатки, диссоциировать ткань сетчатки и пластинчатые клетки сетчатки.