Оптических количественная оценка внутриклеточный pH в Drosophila melanogaster Malpighian трубочку эпителия с флуоресцентные генетически закодированный pH индикатор

Общая цель этого протокола визуализации состоит в том, чтобы описать количественную оценку внутриклеточного pH с использованием генетически закодированного индикатора pH и продемонстрировать, как этот метод может быть использован для оценки базолатерального транспорта протонов в модели почечной структуры насекомого, мальпигиевых канальцев. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного транспорта, такие как то, как специфические белки-транспортеры участвуют в движении эпителиальных протонов во внутриклеточной регуляции pH. Основное преимущество этого метода заключается в том, что клеточный транспорт может быть быстро и легко оценен через несколько функционально различных зон интактного эпителия.

Хотя этот метод может дать представление о регуляции pH и эпителии насекомых, он также может быть применен к другим системам, таким как нефрон млекопитающих и эпителиальные клетки в культуре. Чтобы начать эту процедуру, поместите два комплекта зажимов для рук для пайки на предметный столик микроскопа, по одному зажиму с каждой стороны. Далее вставьте соответствующие изогнутые стеклянные капилляры и линию притока, а также подключенную к вакууму линию оттока.

Затем установите их в помогающие руки и выровняйте их относительно предметного столика микроскопа. Нанесите вакуумную смазку на потолочную ленту и прижмите к ленте разделитель для изобилия клея, чтобы покрыть дно смазкой. Снимите с клеевого перфузионного колодца разделитель и положите его жирной стороной вниз на предметное стекло, покрытое поли-лизином.

После этого снимите делитель перфузионных лунок, чтобы оставить отдельные специфические лунки в гидрофобной смазке. После этого поместите 200 микролитров IPBS комнатной температуры или буферного раствора фосфата насекомых в смазанную маслом и хорошо обведите на предметном стекле, покрытом поли-лизином. Затем поместите предметное стекло под стероскоп, налейте ледяную среду Шнайдера в чашку для препарирования и перенесите в нее одну самку мухи под наркозом.

Держите муху за грудную клетку с помощью набора щипцов, а другим аккуратно захватите заднюю часть живота. Раскройте задний конец ширинки короткими обдуманными движениями. Как только задний гард станет виден, возьмитесь за дистальный конец и освободите кишечник и антес от нижележащих трахей, оттягивая заднюю защиту от тела с помощью повторяющихся коротких рывков.

Затем отщипните передние отверстия мочеточника тонкими щипцами, как только второй набор антес освободится от брюшной полости. Поднимите свободные передние отверстия с помощью стеклянного стержня полюса, просунув стержень под мочеточник таким образом, чтобы канальцы опускались в обе стороны. После этого поднимите антес прямо вверх, из раствора, после этого поверните стеклянный стержень так, чтобы антес и мочеточник прилипли к нижней стороне стержня.

Опустите мочеточник прямо на предметное стекло, затем закрепите мочеточник и запечатайте дистальные концы анте, дополнительно прижав мочеточник к предметному стеколу. Используйте тонкий конец стеклянного стержня, чтобы аккуратно провести каждой трубочкой по поверхности предметного стекла. Прижмите стержень к предметному стеколу, чтобы не раздавить канальец, и проведите стержнем по верхней части канальца, двигаясь от дистального к проксимальному, чтобы прикрепить каждую трубочку по всей длине к поверхности предметного стекла, покрытого поли-лизином.

Успех этой методики полностью зависит от точной идентификации и бережного обращения с передними мальпигиевыми канальцами. Поврежденные канальцы дадут нестабильные результаты. Затем поместите разделитель адгезионного колодца обратно на предметное стекло, чтобы образовать небольшую жидкость, заполненную колодцем над установленной трубочкой.

После этого поместите образец на предметный столик микроскопа. Расположите капилляры притока и оттока над входным и выходным отверстиями обильной лунки соответственно. В этой процедуре включите микроскоп, источник света и систему визуализации, затем откройте программное обеспечение для визуализации.

Смотрите в окуляры и вручную настраивайте фокус до тех пор, пока люмен антес не станет хорошо виден под проходящим светом. Затем перейдите на вкладку сбора данных и выберите 2x2 в раскрывающемся меню затемнения в разделе загрузки объекта. Вставьте фильтр нейтральной плотности 5% в световой путь, чтобы уменьшить освещенность и свести к минимуму фотообесцвечивание.

Нажмите на канал GFP в меню каналов, затем нажмите «В реальном времени», чтобы наблюдать за флуоресцентным сигналом с помощью камеры. После этого отрегулируйте бегунок времени, чтобы установить время экспозиции таким образом, чтобы самые яркие значения пикселей на гистограмме интенсивности составляли примерно 40% от максимального значения. Затем нажмите стоп, чтобы остановить подсветку.

Повторите процедуры в канале RFP и подтвердите наличие расширенного начального сегмента переднего отверстия и отсутствие цитотвердых m агрегатов вишни, что свидетельствует о повреждении тканей или гиперэкспрессии. После этого включите протокол покадровой съемки, установив флажок «Временные ряды». Отрегулируйте продолжительность в раскрывающемся меню, в разделе временных рядов на 10 минут, а ползунок интервала на ноль, чтобы установить общее время съемки с максимальным получением изображения.

Затем отметьте галочками GFP и RFP в разделе канала. Откройте линию IPBS системы Produsion, активировав соответствующий контроллер клапана, и запустите протокол визуализации, щелкнув мышью, начать эксперимент. Через одну минуту переключитесь на последующий раствор хлорида аммония на 20 секунд, открыв соответствующий клапан и закрыв линию IPBS.

Затем вернитесь в IPBS, закрыв линию хлорида аммония и снова открыв клапан IPBS. Чтобы выполнить двухточечную калибровку, снимите делитель лунки, отсоединив его от нижележащего предметного стекла, и удалите обильные капилляры в зажимах из лунки для визуализации. После этого нанесите 200 микролитров калибровочного буфера IPBS с pH 7,4.

Затем удалите раствор из лунки для визуализации и замените его еще 200 микролитрами калибровочного раствора. Повторите этот процесс четыре раза, чтобы обеспечить полную замену решения. Затем инкубируйте раствор для приготовления и калибровки в течение 30 минут перед визуализацией.

Повторите протокол визуализации с теми же параметрами, которые были определены ранее, с изменением всего одной минуты захвата изображения. Затем добавьте 200 микролитров калибровочного буфера IPBS до pH девять. Извлеките раствор из лунки для визуализации и замените его еще 200 микролитрами калибровочного раствора.

Затем инкубируйте препарат во втором калибровочном растворе в течение 10 минут перед визуализацией и повторите протокол визуализации. После этого просмотрите захваченное изображение, наложенное в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы убедиться, что ни один пиксель ни в одном из каналов не насыщен, нажав MeanROI и что ни одно из значений, указанных в гистограмме интенсивности, не достигло максимально допустимого значения, прокручивая стопку изображений с помощью ползунка кадров. Далее проанализируем стек изображений, построив график интенсивности флуоресценции и коэффициента флуоресценции как функции времени, здесь мы видим ожидаемую флуоресцентную реакцию на импульс хлорида аммония в pH-чувствительных и нечувствительных pH каналах индикатора.

Соотношение этих сигналов показывает внутриклеточную рН-транзиторность. Чтобы выполнить этот анализ, сначала нажмите на meanROI и выберите инструмент свободной формы. Удерживайте левую кнопку мыши на мыши, чтобы нарисовать 50 микрометров MT, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить рисование ROI.

Затем повторите это в области, прилегающей к машинному переводу, чтобы определить фоновую рентабельность инвестиций. Далее нажмите среднюю интенсивность в разделе измерения, создайте таблицу значений интенсивности, нажав экспорт, таблица данных, создать. Нажмите на значок колесика часов конфигурации и снимите все параметры, кроме времени и средней интенсивности.

Щелкните правой кнопкой мыши вкладку только что созданной таблицы данных, выберите «Сохранить как» и экспортируйте данные в виде файла CSV. Здесь показано широкоугольное изображение, суперэллиптическая флуоресценция фтора в основных клетках переднего переднего и звездчатых клетках переднего переднего. Обратите внимание, что звездчатые ячейки имеют форму перемычки в начальном сегменте, вариабельные в переходном сегменте и демонстрируют отчетливые ячеистые проекции в главном сегменте.

На этом графике показаны калиброванные изменения межклеточного pH в ответ на 20-секундный импульс 40 миллимолярного хлорида аммония в областях интереса. Пунктирные кривые обозначают одиночные экспоненциальные аппроксимации, приложенные к фазе кислотного восстановления после удаления хлорида аммония. Из этого выводятся значения затухающих констант

На этом графике показана скорость экструзии кислоты, построенная в зависимости от внутриклеточного pH, а на этом графике показан кислотный поток, построенный в зависимости от внутриклеточного pH, полученный из экспоненциальных аппроксимации из предыдущего рисунка. После освоения экстракция мальпигиевых канальцев может быть выполнена в течение 10 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что успех полностью зависит от качества вскрытия и точной калибровки индикатора pH.

Этот препарат может быть объединен с другими генетически кодируемыми биосенсорами, такими как флуоресцентные индикаторы кальция и галогенидов, для изучения движения растворенных веществ и внутриклеточной сигнализации в эпителиальных клетках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить здоровые мальпигиевые канальцы дрозофилы, получить изображение генетически закодированного показателя pH и количественно оценить движение протонов в эпителиальных клетках. Не забывайте, что работа с нитроизном может быть опасной и повредить препараты, поэтому при выполнении этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, чтобы гарантировать, что она не загрязнит какое-либо оборудование, которое будет использоваться повторно.