Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном извлечении белков из митрального клапана сердца человека, пригодных для протеомного анализа. Этот метод потенциально может помочь в раскрытии патогенных механизмов заболеваний клапанов сердца, позволяя идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры заболеваний и, как ожидается, терапевтические мишени. Основным преимуществом данного протокола является обеспечение эффективного рабочего процесса экстракции, совместимого со многими аналитическими приложениями.

Результатом является более исчерпывающая характеристика протеома сердечного митрального клапана. Кроме того, данный протокол может быть применен к другим системам, таким как митральный клапан свиньи, который очень похож на человеческий клапан и используется в экспериментальных моделях для оценки функций клапана. Экспериментальную процедуру продемонстрирует Стефания Гиларди, техник моей лаборатории.

Для подготовки человеческого митрального клапана используйте эксплантированное сердце, находившееся в условиях холодовой ишемии от 4 до 12 часов. В чистом помещении извлеките сердце из транспортировочного пакета и поместите его в стерильное ведро. Затем перенесите сердце в бокс биологической безопасности.

Затем, используя одноразовый скальпель, сделайте разрез перпендикулярно большой оси на уровне левого и правого желудочков, примерно в четырех сантиметрах от верхушки. После этого поместите сердце на стерильную салфетку. Затем отодвиньте восходящую аорту и легочную артерию, чтобы получить доступ к своду левого предсердия.

На крыше левого предсердия с помощью пинцета и зондов сделайте разрез вокруг левого ушка, чтобы обнажить митральный клапан. Митральный клапан полностью расположен в левом желудочке. Таким образом, обнажите переднюю створку митрального клапана и заднюю створку митрального клапана.

Передний латеральный и задний медиальный комиссуры определяют границу передней и задней областей. Теперь с помощью ножниц и нетравматичного пинцета препарируйте левое предсердие и стенку желудочка в области митрального клапана. В ходе препарирования определите зону continuidad митрального и аортального клапанов.

Затем отделите переднюю створку митрального клапана от задней створки митрального клапана, рассекая комиссуры, ограничивающие заднюю створку. По завершении процедуры продезинфицируйте поверхность стола в ламинарном шкафу 70% раствором изопропилового спирта и 6% раствором перекиси водорода. Теперь промойте заднюю створку митрального клапана в физиологическом растворе.

Затем разрежьте клапан на маленькие кусочки, каждый из которых по площади не превышает одного квадратного сантиметра. Заверните каждый кусочек в алюминиевую фольгу и подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте. Чтобы приступить к экстракции белка, извлеките образец из жидкого азота с помощью пинцета и немедленно поместите его на сухой лед.

Не допускайте размораживания образца. Затем поместите ступку, соответствующие пестики и образец в сосуд Дьюара с жидким азотом. Крайне важно использовать жидкий азот для замораживания образца и охлаждения системы измельчения.

Этот этап предотвращает биологическую деградацию и обеспечивает эффективное измельчение в порошок, однако требует специальной подготовки для безопасного обращения. После мгновенного замораживания поместите ступку и пестики в полистирольный бокс с сухим льдом. Также поместите шпатель на сухой лед.

Затем извлеките образец из фольги и поместите его в ступку. Расположите над ним более крупный пестик. Поворачивая пестик с помощью отвертки, перетрите образец от 15 до 20 раз.

Во время растирания перемешивайте образец кончиком охлажденного шпателя. После использования большого пестика повторите процесс растирания с помощью более мелкого пестика. Получение тонкодисперсного порошка имеет решающее значение для эффективной экстракции белков.

Теперь перенесите порошкообразный образец в центрифужную пробирку объемом 15 millileter с известной массой. Затем с помощью холодного шпателя сбейте оставшийся материал в ступку. Держите пробирку с образцом на сухом льду и быстро определите массу образца.

Затем перенесите образец в стеклянную трубку гомогенизатора. После этого добавьте 200 µL мочевинного буфера на каждые 10 mg образца. При этом смойте остатки из трубки, используя аликвоту мочевинного буфера.

Теперь гомогенизируйте образец с помощью моторизованного пестика из ПТФЭ, работающего при 1 500 об/мин. Медленно прижимайте пестик к образцу с вращательным движением 10 раз. Затем с помощью стеклянной пипетки перенесите вязкий желтый супернатант в чистую центрифужную пробирку объемом 1,7 мл.

Теперь повторите гомогенизацию оставшейся части образца, используя в два раза меньшее количество мочевины. Соберите супернатант и объедините его с предыдущей порцией. Затем поместите пробирку в ротатор для пробирок на 30 минут.

Через 30 минут поместите пробирку в охлажденную центрифугу и центрифугируйте образец при 13 000 G в течение получаса. Затем сберите супернатант. Измерьте концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда.

После выполнения предписанного протокола белковый экстракт был изучен с использованием различных методов после проведения ряда дополнительных процедур. Всего в ткани митрального клапана было идентифицировано 422 белка с помощью двумерного электрофореза, жидкостного изоэлектрического фокусирования, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и 2D жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Эти 422 белка были классифицированы с помощью анализа Gene Ontology.

В составе внеклеточных областей было обнаружено несколько ожидаемых белков, а также иные внутриклеточные и поверхностные белки клеток. Многие из них были впервые идентифицированы в митральных клапанах. Наличие четырех таких белков, ранее не обнаруживавшихся в митральных клапанах, было подтверждено с помощью антител в трех уникальных образцах.

Белки: Septin-11, белок с четырьмя с половиной LIM-доменами 1, дерматопонин и альфа-кристаллин B. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экстрагировать белки из митрального клапана сердца для их последующей идентификации и количественного определения. При должном исполнении и наличии навыка данный протокол может быть выполнен почти за два часа. При выполнении этой процедуры для получения максимального выхода белков с высокой степенью их сохранности крайне важно, чтобы образцы не размораживались во время любого этапа переноса.