Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном извлечении белков из митрального клапана сердца человека, пригодных для протеомного анализа. Этот метод потенциально может помочь раскрыть патогенетические механизмы в области заболеваний сердечных клапанов, позволяя идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры заболевания и, возможно, терапевтические мишени. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он обеспечивает эффективный рабочий процесс экстракции, совместимый со многими аналитическими приложениями.

В результате получена более исчерпывающая характеристика протеума митрального клапана сердца. Кроме того, этот протокол может быть применен и к другим системам, таким как митральный клапан свиньи, который имеет близкое сходство с человеческим клапаном и используется в экспериментальной модели для оценки функции клапана. Демонстрировать экспериментальную процедуру будет Стефания Гиларди, техник из моей лаборатории.

Чтобы подготовить митральный клапан человека, начните с эксплантированного сердца, которое подвергалось холодной ишемии в течение 4-12 часов. В чистом помещении извлеките сердечко из сумки для транспортировки, и положите его в стерилизованное ведро. Далее перенесите сердце в шкаф биобезопасности.

Там с помощью одноразового скальпеля разрежьте перпендикулярно большой оси на уровне левого и правого желудочков, примерно в четырех сантиметрах от верхушки. Затем поместите сердце на стерильную простыню. Затем отодвиньте в сторону восходящую аорту и легочную артерию, чтобы получить доступ к крыше левого предсердия.

На крыше левого предсердия используйте щипцы и кирки, чтобы разрезать вокруг левого предсердия, чтобы обнажить митральный клапан. Митральный клапан полностью содержится в левом желудочке. Таким образом, обнажите большую митральную створку и малую митральную створку.

Переднелатеральная и заднемедиальная спайки определяют границу передней и задней области. Теперь с помощью ножниц и нетравматических щипцов рассеките левое предсердие и толщину стенки желудочка, которая окружает митральный клапан. Во время этого рассечения определите непрерывность митрального аортального клапана.

Затем отделите створку переднего митрального клапана от створки заднего митрального клапана, разрезав вдоль спаек, которые граничат с задней створкой. Когда процедура будет завершена, продезинфицируйте стол шкафа 70%-ным раствором изопропилового спирта и 6%-ным раствором перекиси водорода. Теперь промойте заднюю створку митрального клапана в физрастворе.

Затем разрежьте клапан на небольшие кусочки, каждый меньше квадратного сантиметра. Заверните детали по отдельности в алюминиевую фольгу и заморозьте их жидким азотом. Чтобы начать экстракцию белка, с помощью щипцов извлеките образец из жидкого азота, и сразу же поместите его на сухой лед.

Не допускайте оттаивания образца. Затем в сосуд Дьюара, наполненный жидким азотом, поместите ступку, связанные с ней пестики и образец. Крайне важно, чтобы жидкий азот использовался для замораживания образца и охлаждения системы измельчителя.

Этот этап предотвращает биологическую деградацию и обеспечивает эффективное порошкообразное измельчение, но требует технической подготовки для безопасного обращения. После мгновенной заморозки поместите ступку и пестики в полистирольную коробку с сухим льдом. Также положите шпатель на сухой лед.

Далее извлеките пробу из фольги и загрузите ее в ступку. И расположите над ним пестик большего размера. С помощью отвертки вращать пестик, измельчите образец от 15 до 20 раз.

Во время измельчения перемешайте образец кончиком охлажденного шпателя. После использования большого пестика повторите процесс измельчения с пестиком меньшего размера. Получение мелкого порошка имеет решающее значение для эффективной экстракции белка.

Теперь высыпьте порошкообразный образец в 15-миллилитровую центрифужную пробирку известной массы. Затем смахните остатки материала в ступку с помощью холодного шпателя. Держите пробирку с образцом на сухом льду и быстро определите массу образца.

Далее высыпьте образец в стеклянную трубку для гомогенизатора. Затем добавьте 200 микролитров буфера мочевины на каждые 10 миллиграммов образца. При этом восстановите остатки, оставшиеся в пробирке, промыв их аликвотой буфера мочевины.

Теперь гомогенизируйте образец с помощью моторизованного пестика PFTE, работающего со скоростью 1 500 об/мин. Медленно надавите пестиком на образец вращательным движением 10 раз. Далее перенесите вязкую желтую надосадочную жидкость в чистую центрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра с помощью стеклянной пипетки.

Теперь повторите гомогенизацию на оставшемся образце, используя вдвое меньшее количество мочевины. Восстановите надосадочную жидкость и объедините ее с предыдущим сбором. Далее поместите трубку на вращатель трубки на 30 минут.

Через 30 минут загрузите пробирку в холодную центрифугу и раскрутите образец при 13 000 G в течение получаса. Затем восстановите надосадочную жидкость. И измерьте концентрацию белка с помощью анализа белка Брэдфорда.

После выполнения предписанного протокола экстракт белка был изучен с использованием различных методов после некоторых дополнительных процедур. В общей сложности 422 белка были идентифицированы в ткани митрального клапана с помощью двумерного электрофореза, жидкофазной изоэлектрической фокусировки, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и 2D жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. 422 белка были классифицированы с помощью анализа Gene Ontology.

Внеклеточные области содержали несколько ожидаемых белков и другие внутриклеточные и клеточные поверхностные белки. Многие из них были впервые выявлены в митральных клапанах. Наличие четырех таких белков, ранее не идентифицированных в митральных клапанах, было подтверждено антителами в трех уникальных образцах.

Это белки септин-11, четыре с половиной домена LIM белок один, дерматопонин и альфа-кристаллический B. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как извлекать белки из сердечного митрального клапана для их идентификации и количественного определения. После освоения этого протокола его можно выполнить почти за два часа при правильном выполнении. При попытке этой процедуры, чтобы получить наибольший выход белков с высокой целостностью белка, жизненно важно, чтобы образцы не оттаивали во время переноса.