Светосвязная реверсивная модуляция митоген-активированного пути протеинкиназы при дифференцировке клеток и Xenopus Эмбриональное развитие

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы использовать свет для контроля сигнального пути митоген-активируемой протеинкиназы в интактных клетках и в эмбрионах Xenopus. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии и биологии развития, например, как временная модуляция активности киназы регулирует самоопределение во время дифференцировки клеток и эмбриональное развитие. Основное преимущество этого метода заключается в том, что активность митоген-активируемой протеинкиназы может быть обратимо контролируема в интактных клетках и в многоклеточных организмах, таких как развивающиеся эмбрионы.

Этот метод может дать представление о кинетике передачи сигналов во время эмбрионального развития Xenopus. Он также может быть применен к другим модельным системам, таким как сокотра, данио рерио или мышь. Сегодня аспирант из моей лаборатории, Вишну Кришнамурти, продемонстрирует эту процедуру.

А Аврора Тюрджена, пост-звезда в моей лаборатории, продемонстрирует все процедуры, связанные с эмбрионами Xenopus. Сначала соберите устройство для культивирования клеток, поместив одну автоклавную стерильную камеру PDMS на стерильную крышку с покрытием PLL в чашке Петри диаметром 60 мм. Затем используйте 0,5 мл 0,25% трипсина для отделения клеток pHK21 из одной лунки 6-луночного планшета для культивирования тканей.

После подсчета плотности клеток с помощью гемоцитометра засейте камеру 20 000 клеток в 200 микролитры среды для культивирования клеток. Через 24 часа после нанесения покрытия клеток трансфектируйте клетки от 50 до 100 нанограммов CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG плазмиды PCaA X в соответствии с протоколом производителя. Через три часа после трансфекции смените среду на 200 микролитров свежей питательной среды и дайте клеткам восстановиться в течение ночи путем инкубации культуры в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и пятипроцентным углекислым газом.

На следующий день начните оптогенетическую индукцию и визуализацию, заменив среду для культивирования клеток 200 микролитрами среды, независимой от углекислого газа. Затем настройте протокол сбора данных. Выберите канал FITC с нонометром возбуждения 488 для оптогенетической стимуляции и канал CRITC с возбуждением 561 нм для отслеживания клеточной локализации белка, меченного mCherry.

Измерьте мощность синего света, поместив измеритель мощности рядом с окном объектива. Общая мощность в два микроватта достаточна для того, чтобы вызвать ассоциацию CIBN CRY2-PHR. Настройте получение метки времени с интервалом в пять секунд.

А общее время захвата две минуты. Примените соответствующий материал для сопоставления индексов в окне цели. Поместите камеру ячейки на предметный столик микроскопа и используйте режим яркого поля, чтобы сфокусироваться на клетках на поверхности покровного стекла с помощью окуляров.

Затем переместите предметный столик микроскопа, чтобы найти трансфицированную клетку под зеленым светом. Записывайте серию изображений с отметками времени в каналы FITC и CITC. На базовом образце изображения показан CIBNGPCAAX, локализованный на плазматической мембране.

Это снимок CRY2 mCherry raf1 до симуляции синего света, в то время как на этом изображении показан снимок CRY2 mCherry raf после десяти импульсов стимуляции синим светом. Сделайте светодиодную матрицу, вставив тональные синие светодиоды в две макетные платы и соединив их с помощью токоограничивающих резисторов. Поместите макетные платы в алюминиевый ящик.

Вставьте два металлических провода для подключения плат к блоку питания. Убедитесь, что длина провода достаточна, когда световой короб помещается внутрь углекислого инкубатора. Затем поместите прозрачный рассеиватель света, который будет выступать в качестве крышки светового короба.

Наконец, откалибруйте выходную мощность каждого светодиода в диапазоне входного напряжения. Используйте мощность ноль целых два милливатта на квадратный сантиметр для 24-часового анализа дифференцировки клеток PC12. Поместите светодиодную матрицу в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с добавлением пяти процентов углекислого газа.

Подключите его к источнику питания с помощью металлических проводов и установите мощность светодиода на ноль целых два милливатта на квадратный сантиметр. Поместите 12-луночную пластину, содержащую трансфицированные клетки PC12, на окно светодиодной матрицы. Выровняйте пластину так, чтобы каждая лунка была полностью освещена.

Применяйте непрерывное световое освещение в течение 24 часов. Чтобы получить изображение дифференцированных клеток, настройте сбор данных для одного снимка. Используйте 200 миллисекунд для каналов GFP и TexasRed.

Сделайте снимки трансфицированных клеток в каналах GFP и TexasRed и сохраните файлы для анализа данных. Начните эту процедуру с изготовления игл для микроинъекций РНК путем вытягивания стеклянных капилляров с помощью капиллярного пуллера. Удалите желейную оболочку с эмбрионов, обработав их трехпроцентным цистеином, разведенным в 0,2 XMMR в течение 15 минут.

Перенесите эмбрионы в трехпроцентный полисахарозный раствор и ноль целых пять десятых XMMR раствор для микроинъекций. Точно введите 500 пикограмм на один нанограмм РНК CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX в каждый эмбрион. Затем культивируют микроинъецированные эмбрионы в растворе для микроинъекций при комнатной температуре.

Когда эмбрионы достигнут стадии мед-гаструлы, переведите их в 0,2-кратный раствор MMR и продолжайте культивирование до желаемой стадии развития. Затем поместите 12-луночный планшет на самодельную светодиодную матрицу для обработки синим светом. Поместите зеркало на верхнюю часть 12-луночной пластины, чтобы обеспечить полное освещение эмбрионов синим светом.

Соберите эмбрионы для гистологического анализа, вестерн-блоттинга или анализа экспрессии генов после воздействия синего света в течение желаемого времени. На этом изображении показаны многоканальные снимки клеток PC12, преобразованных с помощью CRY2-2A-2CIBN после 24 часов стимуляции синим светом при нулевой отметке два милливатта на квадратный сантиметр. Видны репортеры GFP и mCherry.

Кружками отмечены дифференцированные клетки, а квадратами — недифференцированные. Здесь клетки обрабатывались так же, как и на предыдущем изображении, за исключением того, что стимуляция синим светом не использовалась. Никакой дифференциации не наблюдается.

Эти клетки демонстрируют репрезентативные результаты после трансфекции raf1 GFPCaaX, конститутивно активным raf1. Кругами и прямоугольниками обозначены дифференцированные и недифференцированные клетки соответственно. На этой гистограмме показаны коэффициенты дифференцировки клеток PC12, трансфицированных CA-Raf1, совместно трансфицированных CRY2 mCherry raf1 и CIBN GFP Caax и поодиночно трансфицированных CRY2A 2CIBN.

Только клетки, подвергшиеся воздействию синего света, показали значительную дифференцировку. На этом изображении показана морфология нормальных эмбрионов Xenopus без инъекции мРНК и без лечения светом. На этом изображении показаны эмбрионы, которым вводили мРНК CRY2 2A2CIBN и подвергали стимуляции синим светом.

Активация raf1 путем обработки CRY2 2A2CIBN инъекционных эмбрионов синим светом индуцирует эктопические хвостоподобные структуры в области головы. Следуя этой процедуре, можно ответить на дополнительные вопросы, например, как специфическая стадия активации митоген-активированного протеинкиназного пути регулирует экспрессию генов. Этот оптогенетический метод может быть обобщен для управления другими сигнальными путями с аналогичными механизмами активации.