Процедура и ключей оптимизации стратегии для автоматизированной капиллярного электрофореза на основе иммуноферментного анализа метода

Общей целью этой процедуры является демонстрация иммуноферментного анализа капиллярного электрофореза с использованием коммерческой платформы. Эта платформа будет различать и количественно определять белковые мишени из биологического образца, который может быть получен из тканей клеточных культур и биожидкостей. В ходе этого процесса белок исследуется на основе размера, который варьируется от двух до 440 килодальтон.

Преимущество этой автоматизированной процедуры по сравнению с традиционными процедурами, такими как вестерн-блоттинг, заключается в том, что капиллярные электрофоретические иммунологические анализы устраняют необходимость в гелях, передаточных устройствах и ручных промываниях. Кроме того, абсолютное количество необходимого белка примерно в 10 раз меньше, что делает процедуру идеальной для редких типов клеток или ограниченного количества образцов. Кроме того, результаты были получены всего за три часа с использованием автоматизированных систем и, как было показано, являются более количественными и воспроизводимыми, чем традиционные процедуры вестерн-блоттинга.

Подготовьте образцы и реагенты из набора, включая буфер для образцов, дитиотреитол, флуоресцентную мастер-смесь и биотинилированную лестницу в соответствии с вкладышем производителя. Подготовьте образцы белка с помощью вашего любимого метода. Здесь мы выделили экстракт цельной клетки из клеточных культур BEAS-2B.

Разбавьте образцы белка буфером для образца. Смешайте одну часть флуоресцентной мастер-смеси с четырьмя частями разбавленного образца для достижения желаемой конечной концентрации белка. Приведен пример расчета для получения конечной концентрации белка в 70 микролитров 0,2 микрограмма на микролитр, начиная с концентрации запаса белка 1,2 микрограмма на микролитр.

Мастер-микс составляет 1/5 от общего объема, в данном случае 14 микролитров. Чтобы рассчитать необходимый объем запаса белка, умножьте желаемую конечную концентрацию на общий объем и разделите на концентрацию запаса белка. Вычтите мастер-микс и стоковые объемы из общего объема, чтобы рассчитать объем буфера для выборки.

Денатурируйте подготовленные образцы и лестницу, нагревая при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Обратите внимание, что для некоторых белков могут потребоваться более мягкие условия денатурации. Например, 70 градусов в течение 10 минут, чтобы предотвратить агрегацию белков и улучшить миграцию.

Рассмотрите этот вариант, если наблюдается сильное смазывание при более высоких молекулярных массах. Приготовьте желаемые разведения антител в предоставленном разбавителе. Обратите внимание, что антитела обычно используются в более высоких концентрациях для капиллярного иммуноанализа, чем для традиционного вестерн-блоттинга.

Готовьте смесь люминола и перекиси один к одному в свежем виде при каждом использовании. Пипетируйте образцы и реагенты в планшет для анализа, используя объемы, указанные в шаблоне. Цветовая кодировка представляет собой правильную загрузку реагентов и образцов на пластину для анализа.

Пипетка биотинилированного трапа в лунку А1, подготовленные образцы в лунки от А2 до А25. Полученное антитело разбавляет лунки от В1 до В25 и лунки С1. Первичное антитело к лункам от С2 до С25. Стрептавидин HRP в лунку D1. Вторичное антитело к лункам от D2 до D25.

И люминол-пероксидную смесь в скважины с Е1 по Е25. Добавьте буфер для промывки в первые три ряда больших средних лунок пластины. Включите прибор для капиллярного иммуноферментного анализа и откройте прилагаемое программное обеспечение.

Загрузите капиллярный картридж и пробирную пластину в машину в соответствии с инструкциями производителя и начните прогон. Когда прогон будет завершен, убедитесь, что стандарты флуоресценции правильно определены и при необходимости скорректированы. Кроме того, убедитесь, что биотинилированная лестница показывает правильные пики размера для используемого комплекта.

Более подробную информацию см. в кратком справочном руководстве производителя или руководстве по продукту. Оптимизация условий анализа, таких как время воздействия, концентрация белка и разведение антител, важна для получения точных и воспроизводимых результатов. Эти условия специфичны для каждой комбинации антител модельной системы и, следовательно, должны быть определены эмпирически для каждого нового анализа.

Возможность получения количественных результатов зависит от анализа времени воздействия, при котором люминольная подложка не истощается быстро, так как истощение подложки приводит к потере сигнала или его выгоранию. Это можно определить, изучив данные при различных временах воздействия хемилюминесценции, как показано на рисунке 2. Выдержки с использованием используемого инструмента варьировались от пяти до 480 секунд.

Визуализация показала снижение концентрации белка для экстрактов BEAS-2B, исследованных антителом p53 DO-1 при разведении от одного до 500. Коэффициенты сигнала хемилюминесценции, представленные в программном обеспечении прибора как пиковые высоты, накладываются друг на друга. Интенсивность визуальных полос автоматически регулируется прибором и не сопоставима с одной панелью с другой.

Коэффициент сигнала уменьшается при последовательном увеличении экспозиции, если люминол истощается, как показано здесь. Сигнал начинает пропадать, и пик расщепляется на двух самых длинных выдержках. Из-за этого для анализа данных было выбрано короткое время экспозиции — 15 секунд.

Общий ввод белка также должен быть оптимизирован для каждого конкретного анализа и модельной системы. Для количественной оценки измерения должны проводиться в линейном динамическом диапазоне каждого анализа. Где изменения сигнала, измеряемые площадью пика, пропорциональны изменениям количества белка в образце.

Титрование лизата показывает полосу видимости лизата BEAS-2B при зондировании одним к 500 p53 DO-1 или одним к 50 антителами альфа-тубулина. Линейный регрессионный анализ подтверждает, что анализы являются линейными во всем диапазоне испытаний. Общие концентрации белка в середине линейного диапазона были выбраны таким образом, чтобы учесть потенциальную вариацию целевого белка в любом направлении.

В качестве заключительного соображения оптимизации следует оценить надлежащее разведение первичных антител. Использование антител в концентрациях, накладывающих швы, помогает гарантировать, что любые измеренные изменения сигнала обусловлены только изменениями в количестве белка. Два образца белка BEAS-2B, представленные синими и оранжевыми точками, были исследованы последовательно разведенными антителами к альфа-тубулину.

Сигнал хемилюминесценции, измеряемый в виде пиковой площади, был построен в зависимости от разведения антител. Сатурация наблюдалась вблизи разведения один к 50, где кривая начинает заметное плато. Поэтому в качестве оптимального разведения для этого антитела был выбран один к 50.

После просмотра этого видео вы должны чувствовать себя комфортно при подготовке образцов, загрузке образцов и выполнении анализа на капиллярном иммуноферментном инструменте ProteinSimple Wes. После того, как вы освоите эту процедуру, весь прогон может быть выполнен за три часа с 25 образцами. При анализе прогона важно выполнить контроль качества для каждого капилляра и образца.

Это включает в себя проверку стандартов флуоресценции в биотинилированной лестнице. Если пики определены неправильно, следует использовать программное обеспечение для анализа, чтобы в основном определить правильные пики и устранить неправильно идентифицированные пики. Как и в случае со всеми методами молекулярной биологии в лаборатории, носите надлежащие средства индивидуальной защиты, чтобы защитить себя и свои образцы.

Это включает в себя лабораторный халат, перчатки, защитные очки и обувь с закрытыми носками. Важно помнить, что оптимизация должна выполняться для каждой новой измеряемой цели или при использовании различных источников выборки. Этапы валидации и последующего наблюдения включают оценку специфичности антител и сигнала с использованием очищенного белка или эпитопа.

Тестирование динамического диапазона анализа с использованием серии разведений образца и оптимизация разведения антител путем оценки насыщения сигнала в диапазоне концентраций антител. После оптимизации эта процедура капиллярного иммунодефицита должна обеспечить более быстрый, более количественный метод измерения целевого белка биологических образцов по сравнению с традиционными методами, такими как вестерн-блоттинг.