Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицинских исследований, такие как открытие биомаркеров, открытие лекарств, диагностика и скрининг лекарств или антител. Основным преимуществом этого метода является то, что он имеет высокую пропускную способность и может обнаруживать белковые изоформы в высоко воспроизводимой манере. Последствия этого метода распространяются на диагностику многих заболеваний, поскольку он может измерять пораженные белки или их изоформы.

Хотя этот метод может дать представление о путях сигнализации клеток, он также может быть применен к другим системам, где конкретные белки должны быть проанализированы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как анализ шаги трудно узнать из-за трюков, таких как удаление пузырьков, загрузка пластины, и так далее. Во-первых, подготовить образец разбавляя смесь, добавив один микролитер ингибитора DMSO смеси и два микролитров ингибиторов протеазы до 47 микролитров разбавления образца, так что окончательная концентрация DMSO и ингибиторы протеазы является одним X.Dilute ранее изолированных белковых лизатов с использованием образца разбавляя смесь для получения желаемых концентраций.

Далее добавьте 3,325 микролитров стандартной лестницы, шесть микролитров ингибитора протеазы и три микролитера ингибитора DMSO до 137,675 микролитров анолитного премикса. Вихрь образца по крайней мере 15 секунд и держать на льду. Смешайте два подготовленных раствора в соотношении один-три, чтобы окончательные концентрации ингибиторов протеазы DMSO и стандартной лестницы изоэлектрической точки были одним X, а белки в капилляре достигли конечных желаемых концентраций.

После того, как белки добавляются в образец смеси, все шаги будут выполняться на льду или при четырех градусах Цельсия. Поместите 384-хорошо пластины на льду. Загрузите десять микролитров смеси образца в соответствующий колодец пластины, согласно макету шаблона анализа, разработанному с помощью автоматизированного программного обеспечения западной системы blotting.

После этого разбавляют первичные и вторичные антитела разбавлением антител. Затем пипетка десять микролитров первичных антител и 15 микролитров вторичных антител в каждую колодец. Затем смешайте люминол и перекись XDR в соотношении один к одному.

Pipette 15 микролитров перекиси люминола смешивают в каждую колодец. После того, как образцы и reagants были добавлены в тарелку, центрифуга в течение десяти минут при 2500 раз G и четыре градуса по Цельсию, чтобы спина вниз жидкости и удалить пузырьки. Если пузырьки все еще существуют, удалите их вручную, используя тонкий наконечник пипетки.

Откройте автоматизированное программное обеспечение западной системы blotting и нажмите new'from меню файлов. Перейти к макет панели и назначить места для reagants и образцов в 384-хорошо пластины. Сделайте reagant назначение, нажав на колодец в любом месте блока.

Выберите ряд блока по 12 скважин каждый. Далее перейдите на панели инструментов макета и вставьте образец, первичный, вторичный или люминол строки блока. Перейдите на протокольный стекоть и выберите место рейганта в тарелке.

Затем нажмите ячейку в столбце образца и выберите reagant из выпадают меню. Таким же образом, выберите рейгант места для первичного, вторичного и люминола для каждого цикла. Нажмите на клетки по одному в первичном или вторичном столбце антитела и при необходимости измените время инкубации.

Затем добавьте циклы, нажав кнопку Add'button в разделе протокола. В панели шаблона введите информацию, относящуюся к образцу, такую как идентичность первичных и вторичных антител, их номера каталога и разбавления. Сохраните новый файл анализа.

Перед нажатием кнопки start'button быстро проверьте макет, чтобы убедиться, что все правильно. Теперь нажмите start'to начать запуск. Программное обеспечение будет побуждать пользователя удалить отходы, пополнить воду и капиллярную коробку, добавить анолит и католит в лоток ресурса, добавить буфер стирки, а также загрузить пластину в охлажденный лоток образца.

Панель состояния инструмента будет отображаться на экране компьютера через пару минут после начала запуска. Нажмите на сводку запуска, чтобы увидеть панели состояния и разделения. Чтобы наблюдать разделение электрофорез в капилляре, играть фильм разделения для этого капилляра, нажав на желаемый цикл, а затем нажав кнопку воспроизведения в панели управления.

Откройте файл запуска и выберите вкладку экрана анализа. Нажмите edit'and'and'to изменить диапазон точков. Применить соответствующий стандарт изоэлектрической точки.

Добавьте пик подгонки и добавьте пиковое имя. Наконец, выберите данные для использования во вкладке пиков и экспорт данных для дальнейшего анализа. Здесь показана электроферограмма фосфорилированных внеклеточных сигнальных киназы из сосудистого эндотелиального фактора роста, стимулируемого лисатами.

Наблюдается очень высокая индукция фосфорилированных белков с сосудистым эндотелиальным фактором роста. Вставка показывает эндогенный контроль погрузки, HSP 70, что указывает на аналогичную загрузку образцов как для необработанных, так и для обработанных образцов. В обычном иммуноблоте были обнаружены только две полосы, несмотря на то, что фосфорилированные внеклеточные сигнально-регулируемые белки киназы были решены в четыре пика капиллярным изоэлектрическим фокусирующим анализом.

Здесь показана электроферограмма внеклеточных сигнально-регулируемых киназо из сосудистых эндотелиальных факторов роста, стимулируемых лисатами. Вставка показывает тот же контроль загрузки, используемый параллельно. Обычный иммунобло показывает только две полосы, соответствующие внеклеточной сигнал-регулируемой киназы один и внеклеточный сигнал регулируется киназы два.

В то время как с капиллярной изоэлектрической фокусировки, внеклеточный сигнал регулируется киназы белки были решены в шесть пиков, что соответствует всем четырем различным фосфорилированных пиков и два не-фосфорилированных пиков. После освоения, этот метод может быть сделано в течение нескольких часов, в зависимости от количества циклов, если она выполняется должным образом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать более высокие концентрации антител по сравнению с обычными иммуноблотами.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как анализ шаги трудно узнать из-за трюков, таких как удаление пузырьков, загрузка пластины, и так далее. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как разработать анализ, подготовить образцы, запустить анализ, и анализировать данные для наблюдения различных изоформ вашего белка.